钙蛋白酶抑制剂对癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的治疗作用及其机制研究

摘要

背景：癌症恶病质见于多数晚期恶性肿瘤患者，此种状态下机体出现多种物质代谢异常，其中富含肌肉蛋白的骨骼肌组织受影响最大，出现恶病质症状后骨骼肌会呈现严重的消耗状态。尽管许多研究发现骨骼肌消耗主要由泛素-蛋白酶体蛋白降解途径过度激活造成，但该途径不能直接降解完整的肌原纤维，而需要钙蛋白酶系统将肌原纤维降解为游离肌丝片段后，才能发挥蛋白水解的作用。钙蛋白酶抑制剂在许多研究中都被证实能减少蛋白降解、抑制细胞凋亡等情况。本研究拟通过癌性恶病质动物模型和体外细胞实验探讨：不同剂量钙蛋白酶抑制剂对癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的影响；不同种类钙蛋白酶抑制剂联合使用对癌性恶病质小鼠的保护作用；钙蛋白酶抑制剂改善癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的机制研究；钙蛋白酶抑制剂在肿瘤微环境下对小鼠C2C12肌管细胞的保护作用及其可能机制。本研究分为四个部分：
　　第一部分：不同剂量钙蛋白酶抑制剂对癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的影响。
　　目的：旨在探讨不同剂量钙蛋白酶抑制剂对癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的影响
　　方法：SPF级雄性BALB/c小鼠66只（20g-24g），随机分为11组，A组健康对照组，B组阴性对照组，C、D、E组分别为calpastatin低、中、高剂量组， F、G、H组分别为calpain inhibitor IV低、中、高剂量组，I、J、K组分别为calpeptin低、中、高剂量组。每日监测各组小鼠一般情况变化，并于药物干预1周后采集腓肠肌标本，评估小鼠骨骼肌消耗情况及肌组织中钙蛋白酶活性变化。
　　结果：⑴荷瘤小鼠腓肠肌质量均明显低于健康对照组，接受不同剂量抑制剂干预后，中、高剂量组的腓肠肌重量显著高于阴性对照组，而低剂量组则较阴性对照组无明显升高；阴性对照组、低剂量组的腓肠肌/去瘤体质量比值显著低于健康对照组，而中、高剂量组的该比值较健康对照组降低不明显；⑵荷瘤小鼠腓肠肌游离肌丝含量、钙蛋白酶活性较健康对照组明显增加，低剂量组的游离肌丝含量、钙蛋白酶活性较阴性对照组稍降低，而中、高剂量组则较阴性对照组降低更明显，中、高剂量组间差异并无统计学意义。
　　第二部分：不同种类钙蛋白酶抑制剂联合使用对癌性恶病质小鼠的保护作用。
　　目的：旨在探讨不同种类钙蛋白酶抑制剂单独使用及联合使用对癌性恶病质小鼠的骨骼肌消耗及肌细胞凋亡的影响，并观察其对皮下移植瘤增殖、小鼠营养指标及总体生存期的影响。
　　方法：SPF级雄性BALB/c小鼠162只（20g-24g），随机分为9组，每组18只，A组Cachexia组（阴性对照），B组Healthy组（健康对照），C组（calpastatin）， D组（calpain inhibitorⅣ），E组（calpeptin），F组（calpastatin＋calpain inhibitorⅣ），G组（calpastatin＋ calpeptin），H组（calpain inhibitorⅣ＋calpeptin）， I组（calpastatin＋calpain inhibitorⅣ＋calpeptin）。每日观察监测小鼠体质量、肿瘤体积及食物摄入量。药物干预1周后处死每组各10只小鼠，采集血液、腓肠肌及肿瘤标本，记录小鼠腓肠肌、肿瘤及去瘤体质量，腓肠肌石蜡切片HE染色比较肌组织形态改变情况，检测血清生化指标、腓肠肌组织中游离肌丝含量、钙蛋白酶活性及26S蛋白酶体活性，Western-blot法分析游离肌丝中肌球蛋白、肌动蛋白含量、两种主要钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白表达，并结合qRT-PCR法检测腓肠肌中Atrogin-1和MuRF-1 mRNA的表达情况；采用TUNEL法检测石蜡切片肌肉组织的凋亡指数，Western-blot法分析cleaved caspase-3、BAX、BCL-2、PARP、Bid及细胞色素 C等凋亡相关蛋白表达情况；用免疫组化法检测肿瘤组织中Ki-67的表达，评估抑制剂对肿瘤增殖是否存在影响等。另外，通过对每组剩余8只小鼠的生存情况进行对比，进一步讨论此类抑制剂对小鼠的保护作用。
　　结果：⑴Cachexia组终末体质量、腓肠肌质量及肌纤维横截面积均较Healthy组明显下降，各治疗组较Cachexia组有不同程度改善，其中联合治疗组效果优于单药治疗组；⑵Cachexia组小鼠腓肠肌游离肌丝含量及其中肌动蛋白、肌球蛋白含量较Healthy组明显增加，Atrogin-1和MuRF-1的mRNA、蛋白表达及26S蛋白酶体活性也较Healthy组明显增加，各药物治疗组均能够降低上述指标，联合治疗效果优于单药治疗；⑶Cachexia组小鼠腓肠肌钙蛋白酶表达水平较Healthy组差异不明显，IV组、Calpeptin组的表达水平下降，而CAST组相对升高；Cachexia组的Calpastatin蛋白水平表达均低于Healthy组，各治疗组该蛋白水平受是否补充外源性Calpastatin影响；Cachexia组的钙蛋白酶活性显著高于Healthy组，各单药治疗组能使酶活性下降，各联合治疗组则效果更明显；钙蛋白酶活性变化趋势在一定程度上与钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白比例变化趋势相关；⑷Cachexia组小鼠腓肠肌中cleaved caspase-3、BAX蛋白表达及凋亡指数高于Healthy组，IV组、Calpeptin组及IV+Calpeptin组的凋亡相关蛋白表达及凋亡指数下降；Calpastatin不能减少凋亡，反而增加了cleaved caspase-3、BAX的表达及凋亡指数；胞核内cleaved PARP、胞浆细胞色素C及线粒体Bid蛋白的表达水平变化趋势，与上述凋亡相关蛋白及凋亡指数的变化趋势基本一致；⑸Cachexia组小鼠血清中总蛋白、白蛋白、血糖含量明显低于 Healthy组，而甘油三酯含量高于Healthy组，各药物治疗组均能不同程度逆转此种生化改变，以联合治疗组更加明显；⑹钙蛋白酶抑制剂能够不同程度降低肿瘤组织 Ki67的阳性率；⑺通过Kaplan-Meier生存曲线分析显示，荷瘤小鼠也能在一定程度上从钙蛋白酶抑制剂的治疗中获益。
　　第三部分：钙蛋白酶抑制剂改善癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的机制研究。
　　目的：探讨钙蛋白酶抑制剂对小鼠血清炎性细胞因子、骨骼肌氧化应激指标以及骨骼肌合成分解代谢、肌细胞凋亡相关信号通路的影响
　　方法：采用第二部分采集的血清及腓肠肌标本进一步研究。对血清的TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP及IGF-1等指标进行ELISA检测，对腓肠肌匀浆中的MDA含量、SOD及GSH-PX酶活性进行检测，采用Western-blot法检测腓肠肌组织中Akt信号通路中相关蛋白 Akt、FOXO3a、GSK3β、mTOR等蛋白磷酸化水平， MAPK信号通路ERK、p38、JNK等指标及NFκB的核浆分布差异。
　　结果：⑴Cachexia组小鼠血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平及CRP含量均较Healthy组明显升高，各治疗组的上述细胞因子水平及CRP含量较 Cachexia组有下降，其中联合治疗组效果优于单药治疗组；各荷瘤组小鼠的IGF-1水平较Healthy组明显下降，治疗对该指标影响不大；⑵各荷瘤组小鼠的肌肉MDA水平较Healthy组升高，各荷瘤组小鼠的肌肉SOD酶、GSH-PX酶活性较Healthy组显著降低，治疗对上述指标影响不大；Cachexia组小鼠的iNOS蛋白水平较Healthy组升高，各治疗组的iNOS水平较Cachexia组下降，其中联合治疗组效果优于单药治疗组；⑶各荷瘤组小鼠的p-IRS-1水平较Healthy组显著下降，各荷瘤组小鼠肌肉的磷酸化Akt、FOXO3a、GSK3β及mTOR水平较Healthy组升高，治疗对上述指标影响不大；⑷Cachexia组小鼠肌肉组织中p-IκBα、胞核p65含量高于Healthy组，各治疗组的上述蛋白水平均较Cachexia组下降，其中联合治疗组效果优于单药治疗组；⑸Cachexia组小鼠肌肉p-p38蛋白水平高于Healthy组，各治疗组的上述蛋白水平均较Cachexia组下降，其中联合治疗组效果优于单药治疗组；Cachexia组小鼠p-ERK水平高于Healthy组，前者p-JNK水平较后者无明显差别，而各包含 Calpastatin的治疗组中该两种磷酸化蛋白水平均有不同程度升高。
　　第四部分：钙蛋白酶抑制剂在肿瘤微环境下对小鼠C2C12肌管细胞的保护作用及其可能机制。
　　目的：以肿瘤细胞条件培养基对C2C12肌管细胞进行培养，使用钙蛋白酶抑制剂及不同信号通路抑制剂，观察肌萎缩、肌细胞凋亡相关蛋白及信号通路的变化，并进一步探讨造成这些变化的内在机制。
　　方法：将体外培养的小鼠C2C12成肌细胞诱导分化为肌管细胞，采用荧光定量PCR技术对比其中肌性mRNA分子desmin、MyoD、myogenin等的表达差异，鉴定成肌分化的有效性。对分化后的C2C12肌管细胞采用肿瘤细胞条件培养基进行培养，观察肿瘤微环境下肌管细胞的形态改变及m-钙蛋白酶、calpastatin、E3泛素连接酶、Cleaved caspase-3蛋白及钙蛋白酶活性的变化趋势，并通过使用相关信号通路的抑制剂PD98059、SB203580、PDTC及SP600125，进一步探讨其对肌萎缩相关蛋白、肌细胞凋亡相关蛋白表达及其信号通路的影响。
　　结果：⑴经成肌诱导分化的C2C12细胞中desmin和MyoD的mRNA表达水平显著升高，myogenin的mRNA表达略有增加，而Pax7、MRF4的mRNA表达无明显变化；空白对照组肌管细胞的MyosinⅡb蛋白发出的绿色荧光强于阴性对照组，各治疗组绿色荧光强度均较阴性对照组有改善；⑵TCCM培养24h后，各干预组的钙蛋白酶活性、m-钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白较阴性对照组开始出现明显差异，并持续到48h；TCCM培养48h后，各干预组的MuRF-1、Atrogin-1较阴性对照组开始出现明显差异，部分能够持续到72h；TCCM培养48h后，IV组及Calpeptin组的cleaved caspase-3蛋白较阴性对照组显著下降，培养72h后，CAST组的cleaved caspase-3蛋白较阴性对照组显著升高，而IV组及Calpeptin组该蛋白仍在较低水平；⑶TCCM培养48h后C组核p65、p-ERK、p-p38、p-C/EBPβ、MuRF-1及atrogin-1蛋白水平显著高于A组，经Calpain inhibitor IV干预后，上述指标均较C组下降，经PDTC预处理后，核p65、MuRF-1较C组下降，经PD98059预处理后，p-ERK、atrogin-1较C组下降，经SB203580预处理后，p-C/EBPβ、atrogin-1较C组下降；⑷TCCM培养72h后B组、C组中p-JNK、c-Fos、c-Jun蛋白水平升高，而D组两种因素共同作用下该三种蛋白升高更明显，而SP600125预处理的E组及G组能降低三者表达水平；TCCM培养72h后B组、C组中cleaved caspase-3、BAX蛋白水平升高，而D组两种因素共同作用下该两种蛋白升高更明显，SP600125预处理的E组能降低两者表达水平，而SP600125、PD98059联合预处理的G组效果明显。
　　结论：①癌性恶病质可引起小鼠显著的骨骼肌消耗，其机制可能与肌肉钙蛋白酶活性增高，造成骨骼肌中游离肌丝含量增加有关，多种钙蛋白酶抑制剂可改善骨骼肌消耗，其效果在一定范围内呈剂量依赖关系。②癌性恶病质小鼠模型中，钙蛋白酶抑制剂可通过改变calpain/calpastatin比率，抑制钙蛋白酶活性，调控肌原纤维降解；活化的钙蛋白酶增加了骨骼肌泛素 E3连接酶MuRF-1、Atrogin-1的表达，增强26S蛋白酶体活性，促进肌肉蛋白质降解，而钙蛋白酶抑制剂可缓解这一进程，联合使用效果更佳；活化的钙蛋白酶可引起骨骼肌细胞凋亡，可能通过线粒体凋亡途径；人工合成的钙蛋白酶抑制剂可减轻肌细胞凋亡，而过量补充内源性钙蛋白酶抑制蛋白可能引起更严重的肌细胞凋亡；钙蛋白酶抑制剂可在一定程度上改善小鼠血清营养指标、延长生存期。③钙蛋白酶抑制剂对癌性恶病质小鼠自身的氧化应激状态指标及IGF-1/PI3K/Akt信号通路影响不大，但可在一定程度上降低血清中炎性细胞因子水平；癌性恶病质小鼠骨骼肌组织中NFκB通路激活，MAPK/ERK、p38 MAPK通路激活，并且与MuRF-1、atrogin-1基因表达有一定相关性，可能与恶病质骨骼肌萎缩有关，钙蛋白酶抑制剂能够下调上述通路活性。④在肿瘤微环境下 C2C12肌管细胞中，NFκB信号通路被激活，进一步促进MuRF-1基因表达，calpain inhibitor IV可能通过减少IκBα解离抑制NFκB通路，进而减少MuRF-1表达，改善肌萎缩；肿瘤微环境下p38 MAPK信号通路激活，上调核内转录因子C/EBPβ表达，促进Atrogin-1基因表达，calpain inhibitor IV可能通过抑制该通路，进而减少Atrogin-1表达，改善肌萎缩；过量补充内源性钙蛋白酶抑制蛋白Calpastatin，造成了肌细胞凋亡增加，可能通过JNK信号通路介导，ERK信号通路起协同作用。

目录

声明

附录（主要英文缩略词）

第一部分 不同剂量钙蛋白酶抑制剂对癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 不同种类钙蛋白酶抑制剂联合使用对癌性恶病质小鼠的保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 钙蛋白酶抑制剂改善癌性恶病质小鼠骨骼肌消耗的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第四部分 钙蛋白酶抑制剂在肿瘤微环境下对小鼠C2C12肌管细胞的保护作用

前言

第一节 不同钙蛋白酶抑制剂在肿瘤微环境下对小鼠C2C12肌管细胞的影响

第二节 Calpain inhibitor IV在肿瘤微环境下对小鼠C2C12肌管细胞NFκB、MAPK信号通路及E3泛素连接酶的影响

第三节 Calpastatin在肿瘤微环境下对小鼠C2C12肌管细胞凋亡的影响及其相关信号通路研究

全文总结

参考文献

综述：癌症恶病质的形成机制及治疗进展

攻读学位期间完成的学术论文

致谢