微小RNA195对间歇低氧致海马神经细胞凋亡的调控

摘要

目的：探讨miR-195对慢性间歇性缺氧（CIH）条件下C57BL/6小鼠海马神经细胞凋亡的调控作用。慢性间歇低氧可造成心血管和代谢性相关疾病和认知功能障碍。微小RNA（microRNA）是一种长度只有20-23nt的内源性非编码单链RNA，在转录后水平发挥广泛而重要的负调控作用。最近的研究关注CIH中microRNA的作用，发现特定microRNA可以调控慢性间歇缺氧诱导的凋亡。然而目前microRNA在慢性间歇缺氧海马神经细胞细胞凋亡的调控作用尚不明确。
　　方法：建立慢性间歇低氧C57BL/6小鼠模型，用PCR方法检测海马神经细胞miR-195表达。分离 C57BL/6小鼠海马组织，接种细胞悬液进行原代海马神经细胞培养。用Lipofectamine2000在无血清Opti-MEM培养基中用miR-195抑制剂、miR-阴性对照在IH条件下转染不同组的海马神经细胞，分为转染miR195 inhibitor组-慢性间歇低氧组、转染microRNA negative组-慢性间歇低氧组、未转染-慢性间歇低氧组、常氧组。将培养基置于低氧舱内，向舱内循环充入1.5％O215 s及21％O2225 s，共60循环。PCR检测细胞凋亡相关bcl-2、bax的表达。Western blotting检测bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表达。通过TUNEL法评价海马神经细胞凋亡。统计采用SPSS18.0软件。
　　结果：慢性间歇低氧条件下C57BL/6小鼠海马神经细胞miR-195表达增加。MiR-195的表达在IH组中显着上调，并且在干扰组中表达下降。在CIH条件下，bax mRNA的表达显着增加，而bcl-2 mRNA的表达明显低于空白组。与CIH组相比，miR-195的下调可以显著增加间歇性缺氧下bcl-2 mRNA的表达，降低bax mRNA的表达(p＜0.05)。蛋白质印迹法同样显示，CIH条件下 caspase-3和 bax蛋白的表达较对照组增加，而 bcl-2蛋白较对照组下降。MiR-195inhibitor转染组caspase-3和bax蛋白的表达较CIH组减少并且bcl-2的表达较 CIH组表达增加。TUNEL法检测结果显示，间歇低氧组海马神经细胞凋亡率较正常对照组显著增高，miR-195 inhibitor组较间歇低氧组显著降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　结论：CIH状态下小鼠海马神经细胞miR-195表达增加。通过阻遏miR-195的表达可降低bax、caspase-3的表达，增加bcl-2的表达从而阻遏小鼠海马神经细胞因间歇性低氧诱导的凋亡。上述结果提示 miR-195可能可以作为慢性间歇低氧相关的海马神经细胞损伤的防治靶点。

目录

声明

附录

缩略语/符号说明

前言

仪器与材料

第一部分 慢性间歇低氧小鼠海马神经细胞miR-195表达

研究方法

1慢性间歇低氧C57BL/6小鼠模型建立

2 C57BL/6小鼠海马组织的分离

3 Trizol法提取总RNA

4 定量逆转录PCR检测miR-195

结果

1检测扩增产物的特异性

2 C57BL/6海马神经细胞中miR-195的表达

第二部分 慢性间歇缺氧模式下C57BL/6小鼠海马神经细胞通过miR195对其凋亡的影响

研究方法

1 C57BL/6小鼠海马神经细胞的分离、培养与鉴定

2 miR-195低表达干预实验

3 定量逆转录PCR检测miR-195

4 RT-PCR测四组凋亡相关mRNA：bcl-2 mRNA、caspse3 mRNA、bax mRNA

5 Western-blot检测各组海马神经细胞中bcl-2、 bax、 caspase-3蛋白表达

6 TUNEL检测海马神经细胞凋亡

7 统计学分析

结果

1 实时定量PCR检测慢性间歇低氧组小鼠海马神经细胞miR-195

2 实时定量PCR检测各组小鼠海马神经细胞bax mRNA

3 实时定量PCR检测各组小鼠海马神经细胞bcl-2 mRNA

4 Western-blot检测

5 TUNEL 法检测海马神经细胞凋亡

讨论

结论

参考文献

综述:认知功能障碍与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征相关研究进展

致谢