脊髓神经元机械损伤后自噬诱导通过PI3K/AKT/mTOR介导线粒体途径凋亡

摘要

目的：
　　探讨脊髓神经元机械损伤后调控PI3K/AKT/mTOR通路介导的自噬和线粒体凋亡之间关系。
　　方法：
　　（1）清洁级孕16天SD大鼠，用于脊髓神经原代细胞培养，细胞培养至第7天按照阙海萍方法建立体外神经元机械损伤模型；
　　（2）普通光学显微镜观察神经元细胞生长状态，利用神经元特异性抗体TUBB3、NSE鉴定神经元纯度；
　　（3）在损伤后不同时间点（1h、4h、8h、24h）收集胞浆蛋白，western blot分析自噬（LC3）和凋亡相关蛋白（caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、cytochrome c）；
　　（4）TUNEL法检测不同实验组（control、SCI、SCI+LY294002、SCI+BAF）神经元细胞凋亡水平；
　　（5）JC-1试剂盒检测各实验组线粒体膜电位水平；
　　（6）AO染色检测各实验组神经元机械损伤后自噬溶酶体表达情况；
　　结果：
　　（1）通过普通倒置显微镜连续观察培养的神经元细胞，可见神经元胞体较小，并有突触形成。免疫荧光鉴定结果显示，大部分神经元均可被标记，神经元纯度较高。
　　（2）损伤后诱导凋亡：JC-1荧光染色显示，在神经元损伤后8h线粒体膜电位出现明显降低（p<0.05）；线粒体凋亡蛋白Bax、cytochrome c、cleaved
　　caspase-3在损伤后8h出现明显增加（p<0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2则在损伤后1h表出现表达高峰，随后开始降低；
　　（3）损伤后诱导自噬：western blot结果显示，神经元损伤后4h便开始出现增加，24h达到高峰水平（p<0.05）；运用Bafilomycin A1干预后能减少自噬水平发生；
　　（4）AO染色结果显示，对照组胞浆中红色荧光较弱，随着损伤时间增加，在损伤后4h，胞浆中红色荧光出现增加（p<0.05），24h后胞浆中红色荧光最强。
　　（5）PI3K/AKT/mTOR信号通路：western blot结果显示，神经元损伤后1h AKT磷酸水平出现明显增加，4h后达到高峰水平（p<0.05），其下游mTOR磷酸化水平1h后出现明显增加，4h达到高峰（p<0.05）；在损伤后24h给予PI3K抑制剂LY294002后，下游AKT及mTOR磷酸水平受到抑制，其自噬水平则出现明显增加（p<0.05）；
　　（6）TUNEL结果显示，给予LY294002后细胞凋亡水平较单纯损伤组有明显降低（p<0.05）。
　　结论：
　　（1）神经元机械损伤后能诱导自噬和凋亡发生，并且自噬发生水平早于凋亡；
　　（2）脊髓神经元机械损伤后通过PI3K/AKT/mTOR信号通路介导自噬，抑制该信号通路磷酸化水平能增强自噬并减少细胞凋亡；

目录

声明

缩略语表

前言

1. 自噬在脊髓损伤中作用

2. PI3K/AKT/mTOR信号通路在自噬调控机制

3. PI3K/AKT/mTOR信号通路与线粒体凋亡

1. 实验材料

1.1 细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2. 实验方法及分组

2.1 脊髓神经元原代培养

2.2 神经元鉴定

2.3 实验分组及神经元机械损伤模型的建立

2.4 免疫印迹

2.5 JC-1检测线粒体膜电位水平

2.6 TUNEL法检测细胞凋亡水平

2.7 AO染色检测细胞自噬水平

2.8统计学处理

3 结果

3.1 原代脊髓神经元的培养

3.2 NSE、TUBB3免疫荧光与DAPI核染色质荧光双标结果

3.3 脊髓神经元总蛋白浓度测定

3.4 Western blot检测细胞凋亡蛋白表达

3.5 JC-1检测神经元损伤后线粒体膜电位水平

3.6 脊髓神经元机械损伤后自噬发生规律

3.7 神经元机械损伤后胞浆中酸性自噬溶酶体的变化

3.8脊髓神经元机械损伤后通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬

3.9机械损伤后自噬信号通路与凋亡之间关系

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:神经元自噬与PI3K/AKT/mTOR信号通路研究进展

致谢