Id4对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭转移能力的影响及机制初步探讨

摘要

目的：研究分化抑制因子4（Inhibitor of differentiation4，Id4）对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭转移相关能力的影响,并探讨可能的作用机制。
　　方法：实时荧光定量PCR和western blot检测结直肠癌细胞中Id4的mRNA水平和蛋白的表达情况。以慢病毒为载体将Id4基因导入结肠癌细胞株HCT116，获得过表达Id4的HCT116细胞株。采用WST检测法、实时细胞分析仪检测（RTCA）、克隆形成实验及FACS细胞周期分析检测细胞增殖能力变化；划痕试验和transwell迁移及侵袭实验检测细胞侵袭转移能力的改变；显微镜下观察细胞形态，分析EMT改变。Western blot检测增殖相关蛋白、转移相关蛋白、EMT标志蛋白及PI3K通路蛋白表达的改变。应用免疫共沉淀（Co-IP）与质谱分析技术检测并鉴定与Id4相互作用蛋白。
　　结果：
　　1.Id4在四种结直肠癌细胞 HCT116、SW480、SW620和 HCT-8中均呈不表达或低表达状态，在正常肠上皮细胞中正常表达。
　　2.过表达Id4后HCT116细胞增殖及克隆形成能力均受到抑制（p＜0.05），同时细胞周期阻滞在G0/G1期（p＜0.05）；进一步分析显示增殖相关蛋白survivin、PCNA及周期相关蛋白bcl-2、cyclinD1、cyclinE表达下调，p21、p27表达上调；PI3K/AKT通路中的p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT表达下调（p＜0.05）。
　　3.Id4过表达的HCT116细胞划痕愈合能力及transwell迁移和侵袭能力都降低，并且侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP7表达下调，TIMP1、TIMP2表达上调（p＜0.05）。
　　4.与阴性对照组不同，过表达Id4的HCT116细胞形态由长梭型变为正圆形；EMT相关标志E-cadherin上调，β-catenin、twist、slug、snail下调（p＜0.05）。
　　5.通过Co-IP检测及质谱等技术鉴定，发现Id4可以与角蛋白 K18结合，并下调细胞内K18、p-K18（S33）、p-K18（S52）的表达。
　　结论:
　　1.Id4可通过降低survivin、PCNA、bcl-2、cyclinD1和cyclinE分子表达水平，抑制PI3K/AKT通路，从而抑制HCT116细胞的增殖。
　　2.Id4可下调MMP2、MMP7，上调TIMP1、TIMP2来抑制HCT116细胞侵袭转移；Id4通过上调E-cadherin，下调β-catenin、slug、snail和twist，抑制HCT116细胞的EMT。
　　3.Id4可与角蛋白K18结合，降低细胞中K18的水平，并抑制其磷酸化，可能是Id4抑制HCT116侵袭转移的分子机制之一。

目录

声明

附录

引言

第一部分 Id4过表达对HCT116细胞增殖能力的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 Id4对HCT116细胞侵袭转移能力及EMT的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分Id4与K18结合抑制HCT116细胞侵袭转移的机制探讨

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

综述:分化抑制因子4（Id4）与肿瘤恶化的相关性

致谢