ASCT2抑制剂联合谷氨酰胺合成酶抑制剂抑制谷氨酰胺非依赖型胃癌细胞的增殖生长

摘要

胃癌是中国乃至全世界范围都是高发肿瘤之一，在中国胃癌发病率和死亡率都居于第二。根治性手术治疗是胃癌治疗的主要手段，但是在中国很多患者在被诊断为胃癌时都已经到了晚期。有淋巴结远处转移的患者即是经历了胃癌根治术，仍有一半以上会肿瘤复发。胃癌的治疗方式还有术前化疗，新辅助化疗，放疗和分子靶向治疗，但是总的来说患者5年生存率还是较低，因此新的胃癌治疗方式有待研究探索。
　　ASCT2，又称SLC1A5（Solute Carrier Family1 Member5）是细胞表面Na+依赖性的中性氨基酸转运蛋白,可以调节谷氨酰胺的摄入。在正常细胞中谷氨酰胺虽然是非必需氨基酸,但是如果缺乏谷氨酰胺会对细胞的生长影响明显。肿瘤细胞对谷氨酰胺的需求大幅增加，用来支持代谢需求，产生ATP和合成蛋白质、核酸等大分子物质。细胞内谷氨酰胺浓度升高会持续激活的关键mTORC1信号、促进细胞生长以及减少细胞凋亡。抑制ASCT2蛋白阻止胞内谷氨酰胺的摄入是一种新的肿瘤治疗方式，并已经在黑色素瘤肿瘤细胞,前列腺癌，乳腺癌和急性髓性白血病上证明其有效性。
　　本研究第一部分首先检测了6株胃癌细胞及正常胃粘膜组织的ASCT2蛋白表达情况，然后用ASCT2抑制剂GPNA和BenSer分别处理胃癌细胞。我们发现6株胃癌细胞ASCT2蛋白相对于正常粘膜组织都表达较高，而对ASCT2抑制剂的反应是不一样的，其中胃癌细胞AGS,MGC-803，MKN-74在用ASCT2抑制剂处理后生长明显减慢，而胃癌细胞HGC-27，MKN-45，NUGC-3在用ASCT2抑制剂处理后细胞增殖没有受到明显的影响。
　　第二部分在第一部分的基础上研究不同胃癌细胞对ASCT2抑制剂反应不同的原因。我们首先在外界谷氨酰胺缺乏的条件下培养6株胃癌细胞，得到的结果与第一部分一致：AGS, MGC-803，MKN-74三株胃癌细胞在谷氨酰胺缺乏时生长停滞，我们称其为谷氨酰胺依赖型细胞；而HGC-27，MKN-45，NUGC-3三株胃癌细胞在外界谷氨酰胺缺乏时能够继续生长，我们称其为谷氨酰胺非依赖型细胞。通过Western blot实验，我们发现谷氨酰胺非依赖型胃癌细胞在谷氨酰胺缺乏时，谷氨酰胺合成酶（GS，glutamate synthetase）表达增加，而谷氨酰胺依赖型胃癌细胞在谷氨酰胺缺乏和存在时，谷氨酰胺合成酶蛋白表达极少，甚至几乎不表达。因此，我们推测谷氨酰胺合成酶可能是决定胃癌细胞对谷氨酰胺依赖性的重要因素。我们用lipofectamine3000转染的方法，对谷氨酰胺依赖型胃癌细胞转染GS过表达质粒，发现GS过表达后胃癌细胞对谷氨酰胺缺乏耐受增强；对谷氨酰胺非依赖型胃癌细胞转染shGS敲除质粒，发现GS敲除的胃癌细胞在谷氨酰胺缺乏时生长明显受限。这些实验结果验证了我们之前推论的正确性。基于此结果，我们在运用ASCT2抑制剂处理细胞时，对于谷氨酰胺非依赖型胃癌细胞，在使用GPNA或者BenSer时，还需要联合运用GS抑制剂，才能达到抑制肿瘤细胞增殖的效果；对于谷氨酰胺依赖型胃癌细胞，单独使用GPNA或者BenSer就可以达到抑制细胞增殖的效果，再加上GS抑制剂对加强生长抑制效果并没有益处。
　　在第三部分，我们运用免疫组化的方法检测了ASCT2蛋白在193例胃癌组织中的表达情况，发现ASCT2在胃粘膜组织和癌组织中都有表达，并且绝大多数癌组织中的表达量要高于正常粘膜组织。鉴于前面的实验结果，我们在ASCT2高表达的149例组织中又检测了GS的表达，发现GS在胃癌组织中表达普遍较低，但是仍然存在部分GS表达的癌组织。我们推荐对于这些有GS表达的患者，如果在运用ASCT2抑制剂治疗时，还需要联合运用GS抑制剂。

目录

声明

前言

第一部分不同胃癌细胞系对ASCT2抑制剂的差异反应

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分谷氨酰胺合成酶是影响胃癌细胞对谷氨酰胺依赖性的重要因素

引言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第三部分ASCT2转运蛋白和谷氨酰胺合成酶在胃癌组织中的表达情况

引言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

总结

参考文献

致谢

附录一 英文缩略词表

附录二 试剂配方

附录三 主要仪器设备

综述:ASCT2在肿瘤中的研究进展