联合TK-1和TIMP-1基因过表达对大鼠心肌梗死后心室纤维化的影响

摘要

目的：
　　本研究通过制备大鼠急性心肌梗死模型，观察并比较含人组织激肽释放酶1（TK-1）基因或人基质金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）基因过表达或联合基因（TK-1和TIMP-1）表达对心肌梗死后心室纤维化影响，探讨可能的作用机制。
　　方法：
　　本课题采用冠状动脉左前降支结扎术法，制作大鼠急性心肌梗死模型，75只体重250-300g的雄性SD大鼠随机分为6组，假手术组10只，其余大鼠分为5组：1. PBS组；2.对照病毒组；3.TK-1组；4.TIMP-1组；5.联合基因组。除假手术组仅用丝线穿过左前降支外，其余五组均用丝线缝扎左前降支以制备急性心肌梗死模型，分别于心肌梗死交界处采用微量注射器注射 PBS(100ul)、对照病毒载体、TK-1载体、TIMP-1载体、联合基因载体（各组注射重组腺病毒量为1.0×1010pfu/只，存于100ul病毒保存液里）,假手术组不予注射。四周后通过右颈总动脉置管至左心室测定各组大鼠血流动力学数据；处死大鼠后HE染色观察大鼠心肌组织结构的变化，Masson三色染色检测心肌梗死面积，共聚焦免疫荧光检测 TIMP-1和TK-1基因的表达情况，免疫组化检测 I型胶原、III型胶原的表达变化，蛋白免疫印迹技术检测TK-1、 TIMP-1、TGF-β1、smad2及p-Smad2蛋白表达水平。
　　结果：
　　1.经结扎冠状动脉后，心电图ST段呈弓背向上抬高，结扎点以下心肌颜色由红变浅，成功构建大鼠急性心肌梗死模型。
　　2.重组腺病毒载体转染大鼠心肌组织后，对照病毒组、TK-1组及TIMP-1组大鼠心肌组织在荧光显微镜下均可观察到亮绿色荧光（代表EGFP蛋白表达），联合基因组大鼠心肌组织经免疫双荧光染色后，共聚焦荧光显微镜下同时观察到明亮红色荧光及绿色荧光（分别代表TK-1及TIMP-1蛋白表达）；蛋白免疫印迹技术结果提示仅TK-1组及联合基因组有TK-1蛋白表达，仅TIMP-1组及联合基因组有TIMP-1蛋白表达。
　　3.经干预4周后，各组大鼠心功能参数、心肌梗死面积及心肌组织结构情况：TK-1组，TIMP-1组及联合基因组与对照病毒组相比，心肌梗死面积显著缩小， LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax显著升高，LVEDP显著降低（均为 P＜0.05）。与TK-1组或TIMP-1组相比，联合基因组心肌梗死面积缩小明显，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著升高及LVEDP明显降低（均为P＜0.05）。
　　4.急性心肌梗死后各组大鼠心肌组织I型胶原、III型胶原、TGF-β1、Smad2、p-Smad2的表达情况：与对照病毒组相比，TK-1组，TIMP-1组和联合基因组中I型胶原、III型胶原、TGF-β1和p-Smad2表达显著下降（均为P＜0.05），与TK-1组及TIMP-1组相比，联合基因组I型胶原、III型胶原、TGF-β1和p-Smad2的表达明显降低（均为P＜0.05）。各组间Smad2表达情况无统计学差异（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.成功构建大鼠急性心肌梗死模型，携带人TK-1或TIMP-1基因的重组腺病毒载体转染心梗大鼠心肌组织后，TK-1或 TIMP-1基因均获得稳定表达。携带联合基因（TK-1和TIMP-1）的重组腺病毒载体转染后，目的蛋白TK-1和TIMP-1均在心肌组织获得稳定高表达。
　　2.联合基因（TK-1和 TIMP-1）过表达后可缩小大鼠心梗后心肌梗死面积，提高心脏收缩与舒张功能，抑制I型胶原和III型胶原纤维表达。与单基因（TK-1或TIMP-1）过表达相比，联合基因显著改善心功能和抑制I、III型胶原纤维表达。
　　3.联合基因（TK-1和TIMP-1）过表达后，相比单基因过表达，可显著下调纤维化通路蛋白TGF-β1和p-Smad2的表达水平，这可能与TK-1和TIMP-1都部分通过抑制TGF-β1/Smad2通路，抑制心肌纤维化，呈现协同效应，从而更好地改善心梗后的心肌重塑过程有关。

目录

声明

缩略词表

前言

1.实验材料与方法

1.1实验动物

1.2主要试剂、材料

1.3主要仪器及器械

1.4各种缓冲液及其他溶液配制

1.5主要抗体及其工作浓度

1.6实验方法

2 实验结果

2.1大鼠心肌梗死模型心脏大体观察及大鼠存活情况

2.2 SD大鼠冠状动脉结扎前后心电图变化

2.3荧光显微镜观察心肌梗死区心肌组织变化

2.4病毒载体转染后的各组大鼠TK-1和TIMP-1蛋白表达情况

2.5病毒载体转染后对大鼠心功能的影响

2.6 病毒载体转染后各组大鼠心肌组织形态学变化

2.7病毒载体转染后对大鼠心肌梗死面积的影响

2.8病毒载体转染后对心肌组织胶原纤维的影响

2.9病毒载体转染后对TGF-β1、Smad2和p-Smad2的表达影响

3讨论

3.1 TK-1对心梗后大鼠心肌纤维化的影响

3.2 TIMP-1对大鼠心梗后心功能、心肌纤维化的影响

3.3联合基因（TK-1与TIMP-1）过表达对大鼠心肌梗死后心肌纤维化的影响

3.4 联合基因过表达影响心梗后心肌纤维化的机制探讨

4 结论

参考文献

文献综述:组织激肽释放酶与心血管重构

致谢