大鼠妊娠期缺氧对子代鼠内耳全基因表达谱和内耳发育影响的研究

摘要

目的：研究大鼠妊娠期缺氧对子代鼠内耳发育的影响，并初步探讨CIH影响子鼠内耳发育的分子生物学的可能机制。
　　方法：建立SD大鼠妊娠期缺氧模型，研究（1）CIH与子代大鼠内耳发育不良发病的关系：利用听性脑干反应（ABR）检测正常组和缺氧组两组子代大鼠听力反应阈，筛选出正常组听力正常子代大鼠（CON组）和缺氧组听力障碍子代大鼠（MH组），探讨内耳发育不良的形态学特点。（2）对CON组及MH组研究运用基因芯片表达技术:筛选差异表达基因；pathway富集分析显示差异表达基因；使用基因功能（GO）分类方法对基因给予注释、研究妊娠期CIH影响胎儿内耳不同功能分类基因群的表达。（3）研究CIH致Connexin26蛋白表达水平及GJB2基因启动子区域甲基化的改变情况，分析GJB2基因突变和间隙连接蛋白Connexin26的表达之间的关系。
　　结果:（1）第一天缺氧组缺氧1h后,对正常组和缺氧组孕鼠进行动脉血气分析，，确认模型建立成功。（2）分娩得到正常组子代大鼠155只，缺氧组子代大鼠153只。子宫内的间歇性缺氧与子代大鼠的低出生体重具有相关性，且缺氧组子鼠会出现了追赶性生长（Catch-up growth）及早产。（3）分娩1周后子代大鼠进行听性脑干反应(ABR)检测听功能,缺氧组子代大鼠耳聋发生率和正常组子代大鼠耳聋发生率有统计学意义（P＜0.05）。随机选取154只正常组子代大鼠中的21只为正常子鼠组（CON组），随机选取43只耳聋的缺氧组子代大鼠中的21只为缺氧子鼠组（MH组）。（4）HE染色切片：可见清晰CON组Corti器正常，毛细胞完整未见缺损。MH组Corti器仅见外指细胞、外柱细胞、内柱细胞等支持细胞，而内毛细胞，外毛细胞缺失。（5）耳蜗细胞凋亡TUNEL检测CON组仅见极少量阳性细胞，MH组可见Corti器内毛细胞、外毛细胞、血管纹细胞有棕黄色颗粒，TUNEL染色阳性，形态学实验可知，MH组大鼠的内耳Corti器出现了毛细胞凋亡的现象。（6）利用基因芯片技术，筛选妊娠期缺氧对子代大鼠内耳基因表达的影响：共检测23073个基因，依据差异表达基因筛选标准（Pvalue≤0.05）子代大鼠内耳上调有88个基因的表达（Fold Change≧2，Up）；下调有92个基因的表达(Fold Change≥2,Down)。有意义的目的基因，部分如参与维持离子平衡的基因：GJB2、GJB6、Slc7a7、CLDN14（Regulation：down）；转录因子POU4F3（Regulation：down）；水通道蛋白：Aqp5、Aqp7（Regulation：down）；抑制细胞凋亡基因：Bcl2l10、Bcl2l1、Birc3、Birc5、Hells、Nol3、PAK7（Regulation：down）；促进细胞凋亡的基因：Bak1、caspase2、Ltbr、Casp12、Tsc22d3、Dapk1（Regulation：up）。（7）GO分类分析：分子功能差异基因具有电压门控钾通道活性、主动跨膜转运活性、金属离子结合、甲基化CpG结合、氧转运活性等；生物学过程中差异基因主要参与了氧运输、小分子代谢过程、蛋白质转运等；细胞组分的差异基因富集于细胞外间隙、细胞表面、受体复合物、膜固有成分等。（8）pathway富集分析显示差异表达基因主要基中在JNK信号通路、κB信号通路、NOD样受体信号通路等转录失调在内的转导通路。（9）Western Blot检测，CON组内耳组织中的Connexin26蛋白表达水平明显高于MH组（灰度比值:CON组1.059±0.294＆MH组0.725±0.264,F=0.795,P=0.041）。(10)GJB2的基因突变和遗传性非综合性耳聋关系密切，系主要责任基因。实验研究分析GJB2基因启动子区域状态,首次发现存在2个未曾报到的CpG岛。MH组内耳中GJB2基因启动子岛1、岛2区域甲基化率比COH组明显升高。推测GJB2基因启动子区域甲基化水平增高可能是导致内耳中Connexin26蛋白分子水平表达降低原因。
　　结论：（1）妊娠期慢性间断性缺氧使缺氧组子鼠低出生体重、早产，且和子鼠耳聋发生率相关。（2）CIH可改变缺氧子鼠（MH）组内耳全基因表达谱，使JNK信号通路等转导通路失调，差异表达基因有下调维持离子平衡的基因、转录因子、水通道蛋白、抑制细胞凋亡基因，上调促进细胞凋亡的基因等。(3)耳聋主要原因是基因GJB2在缺氧子鼠（MH）组启动子区域甲基化水平增高，致Connexin26蛋白分子水平表达降低，参与毛细胞凋亡。

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