Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒靶向作用恶性黑色素瘤的实验研究

摘要

目的：
　　拟用课题组前期制备的Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒，通过尾静脉给药方式注射入小鼠及大鼠体内，观察该复合微粒的安全性及毒理性，构建恶性黑色素瘤的裸鼠模型，通过尾静脉注射的方式将复合微粒注入荷瘤裸鼠体内，观察复合微粒在裸鼠体内的靶向性及对移植瘤的血管生成和生长抑制作用，为将来恶性黑色素瘤的基因靶向治疗提供新的途径和研究依据。
　　方法：
　　1、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒急性毒性实验
　　以KM小鼠作为急性毒性实验的实验对象，通过尾静脉注射的方式给各组小鼠分别一次性注射400ul五种浓度（91.6mg/kg、152.8mg/kg、254.6mg/kg、424.2mg/kg、707.0mg/kg）的Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒和生理盐水，持续观察2周小鼠的一般情况，2周后处死小鼠，对重要脏器进行病理组织学检查，HE染色和普鲁士染色观察脏器是否受损。
　　2、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒重复给药实验研究
　　以SD大鼠作为慢性毒性实验的实验对象，共分为低、中、高浓度剂量组（35.35mg/kg、70.70mg/kg、353.50mg/kg）及对照组，连续2周通过尾静脉注射各实验组和对照组大鼠1ml复合微粒和生理盐水，第15d停药，再继续观察7d，观察给药后各组大鼠的一般表现和体重变化，随后处死大鼠，取眼球血送检血常规和生化，对重要脏器进行病理学检查，HE染色和普鲁士染色观察脏器是否受损。
　　3、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒体内靶向性研究
　　构建裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤动物模型，将对数生长期的人恶性黑色素瘤细胞（A375细胞）制成细胞悬液，随后接种于裸鼠右腋部皮下组织内，待裸鼠右腋部皮下肿瘤长至约6×6mm2时，将其随机分成靶向组，非靶向组以及空白对照组。靶向组裸鼠通过尾静脉给药方式注射Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒400ul，右腋部臵于4000GS的稳定磁场作用60分钟，非靶向组和对照组裸鼠分别给予400ul的复合微粒和生理盐水，不加磁场，60分钟后处死各组裸鼠，对各组移植瘤组织进HE染色及普鲁士蓝染色观察复合微粒在裸鼠体内的分布情况。
　　4、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒抑制裸鼠移植性恶性黑色素瘤生长的实验研究
　　将构建好的裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤模型分为两组，每组10只。对照组采用尾静脉注射方法向裸鼠体内注射400ul生理盐水溶液；实验组注射400ul复合微粒，随后紧贴裸鼠右腋皮下荷瘤处外加4000GS的稳定磁场，作用60min，每3天一次，共8次。观察并记录各组裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤的增殖及体积变化情况，统计并分析两组之间移植瘤的体积差异，绘制各组肿瘤生长曲线。采用实时荧光定量RT-PCR检测法检测各组裸鼠移植瘤组织中Ang2基因的相对表达量，统计并分析两组之间Ang2基因的表达差异和移植瘤增殖程度之间的关系。采用免疫组织化学法检测各组裸鼠移植瘤的微血管密度，统计并分析两组之间的差异及其与肿瘤生长增殖的关系。用Tunel染色法检测各组裸鼠移植瘤的细胞凋亡率。
　　结果：
　　1、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒急性毒性实验
　　各组小鼠给药后均未出现死亡情况，给药前后各组小鼠的一般情况无变化，高浓度组裸鼠肺组织病理学检查提示肺淤血征象，其余各组重要脏器病理组织学检查未见明显改变，复合微粒的小鼠LD50＞707.0mg/kg，表明其急性毒性相对较低。
　　2、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒重复给药实验
　　给药前后各组大鼠的一般活动和肝肾功能无明显变化，低剂量组大鼠主要脏器病理组织切片检查未见明显异常，中、高剂量组大鼠肺部病理组织切片检查显示慢性肺淤血及纤维化改变，其余脏器未见明显异常，本实验的最低剂量35.35mg/(kg.d)×14d，对大鼠基本无毒性，说明在一定的浓度范围内长期应用该药物是安全的。
　　3、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒体内靶向性试验
　　成功构建了人恶性黑色素瘤裸鼠移植瘤动物模型，各组裸鼠给药后均未出现死亡情况。对照组、非靶向组和靶向组裸鼠移植瘤组织普鲁士蓝染色分别为阴性、弱阳性和强阳性，此结果说明，Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒注射入裸鼠体内后在磁场作用下，可以定向地聚集在移植瘤组织内。
　　4、Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒抑制裸鼠移植性恶性黑色素瘤生长的实验
　　各组荷瘤裸鼠给药后均未出现死亡情况。实验组裸鼠移植瘤平均体积为1200.81±267.32mm3，显著小于对照组裸鼠移植瘤平均体积6312.01±914.62mm3，差异有统计学意义；实时荧光定量RT-PCR结果显示，Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒对裸鼠移植瘤组织中Ang2基因的抑制率达37.33%；MVD计数结果显示，实验组裸鼠的肿瘤微血管密度为11.52±0.93个/HP，显著低于对照组裸鼠的肿瘤微血管密度为15.67±1.51个/HP，差异有统计学意义；Tunel染色结果显示，实验组裸鼠移植瘤细胞凋亡率为5.35±1.81%，显著高于对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡率为3.32±0.97%，差异有统计学意义。
　　结论：
　　Ang2-siRNA质粒壳聚糖磁性纳米微粒在一定剂量范围内使用是安全的，具有靶向给药系统载体的特性，在裸鼠体内可以抑制移植性恶性黑色素瘤血管的发生、生长，可以抑制恶性黑色素瘤的增殖、发展。

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