程序性坏死在大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用研究

摘要

目的：蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）是神经内科、外科常见的一种脑血管急症，最常见病因是颅内动脉瘤破裂。尽管动脉瘤手术和神经重症监护技术不断提升，但SAH患者的病死率和致残率仍然很高。研究认为，早期脑损伤可能是SAH患者死亡和预后不良的主要原因之一。
　　程序性坏死（Necroptosis）是近年来提出的一种新的细胞死亡方式。受体相互作用蛋白1（Receptor-interacting protein1,RIP1）、RIP3和混合系列蛋白激酶样结构域（Mixed lineage kinase domain-like,MLKL）蛋白在这种类型的细胞死亡过程中发挥至关重要的作用，而且作用于RIP1、RIP3、MLKL的特异性抑制剂如Necrostatin（Nec）-1、GSK’872和Necrosulfonamide（NSA）可以显著抑制细胞程序性坏死。此外，RIP1/RIP3/MLKL通路介导的细胞死亡也被广泛认为是程序性坏死的最主要途径。研究发现，程序性坏死与多种常见的神经系统疾病如脑缺血、脑出血和脑外伤等引起的脑损伤密切相关。SAH与这些疾病有部分相似的病理机制，但RIP1/RIP3/MLKL通路介导细胞程序性坏死在SAH后早期脑损伤中的作用尚未被深入研究。
　　因此，本研究旨在明确RIP1/RIP3/MLKL通路介导的细胞程序性坏死在SAH中的激活情况，揭示程序性坏死对早期脑损伤的影响，并探讨程序性坏死特异性抑制剂的神经保护作用及机制,为SAH后干预细胞坏死提供新的靶点，最终提高SAH的治疗效果。
　　方法：1）采用血管内穿刺法建立大鼠SAH模型，应用Western blot和免疫荧光检测RIP1、RIP3和MLKL在SAH早期（72小时内）脑组织中的表达水平，同时使用碘化丙啶染色和电镜明确细胞死亡类型，获得SAH后脑组织发生程序性坏死的可靠证据；将动物随机分为Sham组、SAH+DMSO组和SAH+Nec-1组。在SAH后30分钟经侧脑室注射单一剂量Nec-1或者DMSO，通过评估各组动物的出血程度、神经功能状态、脑水肿和血脑屏障破坏等来评价Nec-1的神经保护作用；在Nec-1的神经保护机制研究中，通过Western blot检测程序性坏死相关蛋白、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9和Bcl-2）、NF-κB p65亚基和MAPKs磷酸化水平，采用酶联免疫吸附试验检测炎症因子释放以及TUNEL染色进一步验证细胞凋亡水平。
　　2）通过培养大鼠原代皮层神经元，采用血红蛋白（Hemoglobin，Hb）诱导建立SAH体外模型。检测Hb处理后各时间点培养液中乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）水平，确定后续实验检测时间点；将培养神经元分为DMSO、zVAD（20μM）、NSA（2μM）、Hb（10μM）、Hb+zVAD、Hb+zVAD+NSA和Hb+NSA共7组，通过检测LDH水平和碘化丙啶阳性细胞数来评估细胞坏死，采用流式细胞仪检测氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)释放，Westernblot检测程序性坏死相关蛋白表达等来探讨NSA的神经保护作用及机制。
　　结果：1）在SAH早期（72小时内），大脑皮层程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3和MLKL表达显著增加，48小时达到高峰。免疫荧光共染结果进一步证实这些蛋白表达上调，并且主要位于神经元胞浆。
　　2）经侧脑室注射单一剂量Nec-1可以显著改善SAH后的血脑屏障破坏、减轻脑水肿、减少坏死性细胞死亡，促进神经功能恢复，但不能减轻S AH严重程度。
　　3）Nec-1显著抑制程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3和MLKL的表达、减少NF-κB核转录和炎症介质释放，同时降低ERK磷酸化水平，但对细胞凋亡活性没有显著影响。
　　4）NSA显著抑制MLKL表达，降低Hb诱导的神经元死亡，提高细胞存活率，但对上游蛋白RIP1和RIP3没有明显抑制作用，也不能减少线粒体ROS聚积。
　　结论：1）在SAH早期（72小时内），大脑皮层存在RIP1/RIP3/MLKL通路介导的细胞程序性坏死激活，坏死细胞主要是皮层神经元，提示程序性坏死可能参与SAH后早期脑损伤。
　　2）Nec-1治疗可以明显减轻大鼠SAH后的脑水肿、改善血脑屏障通透性，减少细胞坏死，促进神经功能恢复。这些结果表明，Nec-1可以减轻SAH后早期脑损伤程度。
　　3）Nec-1在SAH后早期脑损伤中的神经保护作用是在不影响细胞凋亡活性的前提下，通过抑制RIP1磷酸化，阻断RIP1/RIP3/MLKL通路介导的细胞程序性坏死、减轻神经炎症和抑制ERK活性获得的。
　　4）NSA明显减轻Hb诱导的神经元坏死，它的神经保护作用可能与抑制坏死执行分子MLKL，进而阻断程序性坏死信号执行有关。

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