肠道病毒71型在环境标本中检测方法的探索及毒力位点的研究

摘要

目的：
　　1、建立EV71免疫磁珠富集技术与常规检测相结合的方法,应用于患儿周围环境标本检测,从环境标本中分离出EV71病毒,为阐析环境标本在EV71传播中的作用提供确切证据.
　　2、通过分析分离自不同临床症状的EV71毒株的基因组序列,寻找可能与重症病例相关的毒力位点.
　　3、构建突变感染性克隆质粒,拯救病毒,在细胞生物学水平和动物水平上对拯救的突变病毒的毒力进行验证,确定位点突变对病毒毒力的影响.
　　方法：
　　1、制备特异性富集EV71病毒的免疫磁珠,建立对环境标本中的EV71病毒富集和分离的方法,获得的免疫磁珠-病毒复合物进行RT-PCR、RT-qPCR检测和病毒分离.阳性标本进行VP1全长扩增及序列测定分析其同源性.
　　2、对40株福建省EV71分离株的的基因组进行扩增,并从Genbank中下载48株具有明确临床症状的中国其他省份获得的EV71全基因组序列,对基因组进行遗传进化分析;根据分离株病例的临床症状将其分为重症和轻症毒株,比较重症和轻症分离株非编码区的核苷酸序列及编码区的氨基酸序列的变异情况.
　　3、在EV71全长cDNA感染性克隆质粒(Nero-pcr-XL-149-08)的基础上,利用点突变技术构建潜在毒力位点突变的感染性克隆质粒,并在RD细胞上进行病毒拯救.首先在细胞水平上通过温度敏感性及病毒的生长曲线来观察拯救病毒生物学特征的变化,然后将拯救病毒感染乳鼠,通过乳鼠的致死率和临床症状验证拯救病毒的毒力,最后将在细胞和乳鼠中验证有毒力变化的拯救病毒感染转基因小鼠,进一步验证突变位点与病毒毒力的关系.
　　结果：
　　1、免疫磁珠富集技术具有高敏感性和特异性.经过免疫磁珠富集后,346份病例和环境标本RT-qPCR、RT-PCR和细胞培养的阳性率分别为20.52%、5.78%和9.25%,均比未经富集的直接检测阳性率(15.90%,3.47%和4.05%)有显著提高(p<0.05);病例标本和家庭环境标本的EV71病毒分离率在经过免疫磁珠富集后分别从27.45%增加至43.14%和从0到5.29%;在家庭环境阳性标本中,玩具和文具阳性率高,分别占52.00%和24.00%;在幼儿园环境标本中,RT-qPCR的阳性率为6.12%,未能从中分离出EV71病毒.序列分析显示,病例分离株与家庭环境分离株的核苷酸同源性可达98.0-100%.
　　2、获得了40株福建省EV71病毒全基因组序列;福建省EV71流行株与国内同时期流行的EV71病毒的基因型分布一致,可分为C4a和C4b两个分支,其中C4b分支病毒出现于2004年之前,2004年至今的病毒属于C4a分支.40株福建省流行株和48株其他省份EV71分离株,在轻症和重症毒株中以下位点分布存在显著性差异:5?UTR区nt99-100后插入一个C(χ2=4.041,p<0.05)、nt576(T→C,χ2=4.346,p<0.05);编码区VP2-144(T→S,χ2=4.433,p<0.05)、VP1-22(H→Q,χ2=4.041,p<0.05).
　　3、成功构建8个突变感染性克隆质粒,拯救出病毒,分别为M1、M2、M3、M1+2、M1+3、M2+3、M1+2+3和M4+5;与母本株相比,在细胞生物学水平上,M1+2+3拯救病毒感染和复制能力增强,温度耐受;M2拯救病毒感染和复制能力降低,温度敏感;在Balb/c乳鼠实验中,与母本株相比,拯救病毒M1+2+3有更高致死率,M2致死率较低;在SCARB2转基因鼠实验中,拯救病毒M1+2+3有高致死率,能出现瘫痪、弓背、神经应急反应等症状,脑组织出现损伤,M2未出现明显症状.
　　结论：
　　1、应用EV71免疫磁珠富集技术可特异性地提高RT-PCR、RT-qPCR检测和病毒分离的敏感性;利用该技术能够从环境标本中分离出EV71病毒,且其与病例分离株高度同源,确认了环境标本在EV71传播中起重要作用;EV71在家庭环境标本中有较高检出率,尤其是在玩具和文具中,因此需加强对家庭环境的有效消毒.
　　2、福建省分离的EV71病毒与国内同时期流行的EV71病毒的基因型分布一致,均属于C4亚型;重症和轻症分离株在5?UTR区nt99-100(中间插入一个C)、nt576(T→C),编码区VP2-144(T→S)、VP1-22(H→Q)等位点存在变异;
　　3、5＇UTR区nt99-100(中间插入一个C)、nt576(T→C)和编码区VP2-144(T→S)三个位点的联合突变会导致毒力增强,提示该三个位点存在协同作用,;nt576(T→C)位点与中国EV71毒株的毒力有关,但并不是由该单一位点起作用,而是多个位点相互作用的结果.

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