妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞损伤及其DNA甲基化模式改变

摘要

目的：
　　研究并阐明妊娠期镉暴露对F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞生长和激素合成功能的影响及其DNA甲基化模式改变，为进一步阐明镉致卵巢细颗粒细胞胞损伤及其表遗传机制提供科学依据。
　　方法：
　　SPF级成年SD大鼠，合笼受孕后，于妊娠第1-20天分别暴露于0、0.5、2.0、8mg/kg CdCl2，灌胃染毒，每天一次。F1代雌鼠于出生后第56天时，取卵巢颗粒细胞稳定培养24h贴壁后收集细胞（10×106个/ml）及上清液备用。
　　第一部分 妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞凋亡的影响
　　①观察颗粒细胞亚显微结构（透射电子显微镜）；②检测卵巢颗粒细胞凋亡率(AnnexinV-FITC/PI双染)；③检测卵巢颗粒细胞Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Caspase3、及Caspase8基因mRNA（RT-PCR法）和蛋白表达（Western-blot法)。
　　第二部分 妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞激素合成的影响
　　①检测颗粒细胞上清液孕酮、雌二醇水平（ELISA法）；②检测颗粒细胞StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1及Cyp19a1基因mRNA(RT-PCR法）和蛋白表达（Western-blot法）
　　第三部分 F1代大鼠成年后颗粒细胞全基因组DNA启动子区甲基化研究
　　①检测卵巢颗粒细胞（n=3）全基因组DNA甲基化启动子区差异基因表达谱（免疫共沉淀法）；②差异甲基化基因GO分析；③差异甲基化基因KEGG信号通路分析。
　　第四部分：根据芯片检测结果及生物信息学分析提示验证Eif2s1、Atf4启动子区DNA甲基化状态
　　①启动子在线分析软件Methl Primer Express及SignalMap确定Eif2s1、Atf4基因启动子区差异峰落在CpG岛；②验证Eif2s1、Atf4基因启动子区甲基化状态（BSP法）；③测定Eif2s1、Atf基因的mRNA表达水平（RT-PCR）。
　　结果：
　　第一部分：妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞凋亡的影响
　　①与对照组相比，各染镉组出现的凋亡细胞及凋亡小体数量增加，颗粒细胞线粒体、内质网、细胞核、染色质出现不同程度损伤。
　　②与对照组比，各染镉组凋亡率均升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　③与对照组相比，各染镉组Bcl-2、Bcl-xl及Bcl-2/Bax mRNA和蛋白表达均出现不同程度的下调，Caspase3基因mRNA差异无统计学意义，蛋白表达出现不同程度上调，差异具有统计学意义（p＜0.05），各染镉组Bax、Caspases8基因mRNA及蛋白表达差异均无统计学意义。
　　第二部分：妊娠期镉暴露致F1代大鼠成年后颗粒细胞激素合成的影响
　　①与对照组相比，各染镉组颗粒细胞上清孕酮水平显著性下调，差异具有统计学意义（P＜0.01），而雌二醇水平差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　②各染镉组StAR、Cyp11a1基因mRNA及蛋白表达均显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.05），Cyp17a1、Cyp19a1基因mRNA及蛋白表达差异均无统计学意义（P＞0.05），SF-1基因mRNA表达出现不同程度改变，但蛋白差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　第三部分：F1代大鼠成年后颗粒细胞全基因组DNA启动子区甲基化研究
　　①与对照组相比，8.0mg/kg组基因组DNA发生低甲基化基因的数量高于发生高甲基化的基因数,且主要发生在高密度启动子和中密度启动子区。
　　②GO分析提示妊娠镉暴露对F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞相应的生物学过程、分子功能及细胞组分产生影响。
　　③差异性甲基化Pathway分析提示，与对照组相比，镉暴露对F1代大鼠颗粒细胞48条通路产生影响，其中凋亡通路中Eif2s1、Atf4等14个基因启动子区发生了高甲基化，Bcl-xl基因启动子区发生低甲基化，未见Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8基因启动子区甲基化状态发生改变；激素合成基因Cyp1a1、Hsd17b1启动子区发生低甲基化，未见StAR、SF-1、Cyp11a1、Cyp17a1、Cyp19a1基因启动子区甲基化发生改变。
　　第四部分：根据芯片检测结果及生物信息学分析等结果提示验证Eif2s1、Atf4启动子区DNA甲基化状态
　　①Eif2s1、Atf4基因启动子特定区域出现高甲基化峰，此峰落在相应基因CpG岛。
　　②与对照组相比，各染镉组Eif2s1、Atf4基因mRNA表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　③与对照组相比，8.0mg/kg组Eif2s1基因启动子区平均甲基化率增高，差异有统计学意义（P＜0.05），Atf4基因启动子区平均甲基化率差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　根据以上结果，可得出如下结论：
　　1.妊娠期镉暴露可致F1代大鼠成年后卵巢颗粒细胞生长和功能产生影响。
　　2.妊娠期镉暴会改变F1代大鼠成年后颗粒细胞全基因组DNA甲基化状态，引起凋亡及激素合成相关基因甲基化模式发生改变。
　　3.本实验条件下Eif2s1--Atf4通路被抑制，DNA甲基化可能参与其抑制Eif2s1基因mRNA表达的调控，但可能未参与其抑制Atf4基因mRNA表达的调控。

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