mPGES-1及其介导miRNAs信号通路在肝细胞癌恶性进展中的作用及机制的初步研究

摘要

研究目的：
　　构建mPGES-1-RNAi慢病毒（前列腺素E2合成酶-1-RNAi）并感染肝癌细胞，观察干扰mPGES-1基因对肝癌细胞SMMC7721和HepG2体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。采用miRNAs芯片方法检测肝癌细胞HepG2mPGES-1基因被干扰后miRNAs差异表达情况，并加以验证以及相关分析，以期发现mPGES-1介导miRNAs信号通路在肝细胞癌恶性进展中的作用及可能的分子机制。
　　研究方法：
　　（1）构建mPGES-1-RNAi慢病毒并分别感染肝癌细胞SMMC7721和HepG2，同时设置空载体组（NC组）和未感染组（Control组）。采用Western blot、PCR等方法检测干扰mPGES-1基因前后肝癌细胞SMMC7721和HepG2中mPGES-1mRNA及蛋白的表达水平。运用CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测干扰mPGES-1基因对肝癌细胞SMMC7721和HepG2增殖、迁移和侵袭能力的影响。
　　（2）用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测干扰肝癌细胞株SMMC7721和HepG2mPGES-1前后前列腺素E2（PGE2）的含量。
　　（3）采用miRNAs芯片筛选干扰肝癌细胞株HepG2mPGES-1基因后显著差异表达miRNAs，同时用qPCR加以验证，对差异表达最显著的miR-146a-5p用TargetScan、PITA、microRNAorg数据库进行靶基因预测。三个数据库取交集后的共同靶基因进行后续的GO和KEGG Pathway分析。
　　（4）用免疫组织化学方法检测mPGES-1、cyclinD1和EGFR在肝癌组织和癌旁肝组织的表达情况，并分析它们之间的相关性。
　　研究结果：
　　（1）成功构建mPGES-1-RNAi慢病毒并感染肝癌细胞SMMC7721和HepG2，SMMC7721的病毒感染率约为80%，HepG2的病毒感染率约为90%。
　　（2）与未感染组（Control组）、空载体组（NC组）相比，肝癌细胞SMMC7721和HepG2中mPGES-1基因干扰组（LV-2组）mPGES-1mRNA和蛋白表达明显下调，且差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　（3）与未感染组（Control组）、空载体组（NC组）相比，肝癌细胞SMMC7721和HepG2中mPGES-1基因干扰组（LV-2组）PGE2含量明显下调，且差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　（4）CCK8实验及Transwell侵袭实验结果显示：在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中，mPGES-1基因干扰组（LV-2组）与未感染组（Control组）和空载体组（NC组）相比，细胞增殖、侵袭能力明显减弱，且差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　（5）细胞划痕实验结果显示：在肝癌细胞SMMC7721中，相对未感染组（Control组）与空载体组（NC组），mPGES-1基因干扰组（LV-2组）细胞迁移能力明显减弱，且差异有统计学意义（P＜0.05）；在肝癌细胞株HepG2中，相对未感染组（Control组）与空载体组（NC组），mPGES-1基因干扰组（LV-2组）细胞迁移能力有所下调，但差异统计无学意义（P＞0.05）。
　　（6）miRNAs芯片筛选显著差异表达miRNAs与qPCR验证结果相对比：miR-146a-5p、miR-6889-5p、miR-3150b-3p、miR-4470表达上调；miR-20a-3p、miR-23a-5p、miR-629-5p、miR-7-1-3p、miR-6820-3p表达下调，以上结果与miRNA芯片结果相一致，其中上调miRNAs中miR-146a-5p改变最明显，上调倍数为4.12，下调miRNAs中miR-7-1-3p改变最明显，下调倍数为3.70。但miR-5191、miR-2276-3p、miR-892b表达上调，miR-521表达下调，这4个miRNAs的表达情况与芯片结果不一致。
　　（7）差异表达最显著miR-146a-5p的靶基因预测及对靶基因的GO分析和KEGG分析结果显示：miR-146a-5p的候选靶基因有120个，有cyclinD1、EGFR等；且miR-146a-5p的靶基因主要调控基因转录、细胞转移、小GTPase介导的信号转导、脱磷酸作用、T细胞激活等生物学行为，主要富集在：肿瘤相关信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、ErbB信号通路等。
　　（8）免疫组织化学染色结果显示：mPGES-1在肝癌组织中高表达率高于癌旁肝组织（77.78%vs.53.70%），差异有统计学意义（P＜0.05）；cyclinD1在肝癌组织中高表达率高于癌旁肝组织（12.96%vs.1.85%），差异有统计学意义（P＜0.05）；EGFR在癌旁肝组织中的高表达率高于肝癌组织（38.89%vs.72.22%），差异有统计学意义（P＜0.05）。对mPGES-1、cyclinD1、EGFR三者的相关性进行分析，结果显示：mPGES-1与cyclinD1呈正相关、与EGRF呈负相关，同时cyclinD1与EGFR呈负相关，且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　研究结论：
　　（1）成功构建mPGES-1-RNAi慢病毒载体，高效感染肝癌细胞SMMC7721和HepG2，可稳定、显著的降低mPGES-1基因的表达。
　　（2）干扰mPGES-1基因可以减弱肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
　　（3）干扰肝癌细胞HepG2mPGES-1基因前后miRNAs的表达谱发生改变，mPGES-1可能通过miR-146a-5p靶向cyclin D1和EGFR影响肝细胞癌的恶性进展。

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