sFrp3 RNA干扰对小鼠早期牙齿发育的影响研究

摘要

前人研究发现，sFrp3和Wnt-5a在牙乳头间充质中强烈表达，并且用外源性的sFRP3蛋白抑制Wnt信号可使磨牙的发育受到明显的影响，只能形成尺寸很小的牙齿。这些结果都揭示了sFrp3这-wnt信号通路的拮抗物在小鼠牙齿发育过程中起着重要作用。 本实验研究通过RNA干扰降低sFrp3在小鼠牙胚中的表达来研究其对小鼠早期牙齿发育的影响，以期更深入的了解Wnt信号在牙间充质诱导牙齿发育能力中所起的作用。主要研究包括：利用前人构建的sFrp3的RNAi慢病毒载体(HIV-1)通过三质粒表达转染系统生产慢病毒(LV-shsFrp3)，慢病毒分别感染E11.5磨牙牙胚后和E13.5磨牙间充质的成牙分析。 实验结果表明，慢病毒感染E11.5磨牙牙胚后体内培养2天后，实验组的牙胚发育到了蕾状晚期，对照组则处于蕾状早期；4天后，实验组的牙胚发育到了帽状晚期，对照组则处于帽状早期；7天后，二者均具有完整的牙齿结构，但实验组牙本质已成形，而对照组牙本质则尚未出现；8天后，牙胚继续发育，但实验组成釉质细胞和成牙本质细胞均比对照组发育的密集、成熟。由此可见，感染LV-shsFrp3的E11.5的早期牙齿的发育比对照组的牙齿发育快2-3天。慢病毒感染E11.5磨牙牙胚后体外培养实验也表明实验组牙胚发育比对照组快。感染LV-shsFrp3的E13.5重组牙胚(E13.5牙间充质+E10.5牙上皮)成牙率为50％，比对照组的33％高，但牙齿形态和大小并没有什么差别。 抑制小鼠sFrp3的表达会促进牙齿发育加快的原因可能是抑制了sFrp3的表达就在一定程度上加强了Wnt的经典通路和Wnt的平行细胞极性通路，使得牙齿发育加快。由此我们可以得出，Wnt信号系统在早期牙齿发育中起着重要作用。

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摘要

中文文摘

第1章绪论

1.1哺乳动物牙齿的发育过程

1.2哺乳动物牙齿早期发育启动的分子机制

1.2.1介导牙齿发生的生长因子(Growth Factors，GF)

1.2.2转录因子在牙齿发育中的作用

1.3 Wnt信号通路

1.3.1 Wnt信号的四条传导通路

1.3.2 Wnt信号通路的分泌型拮抗剂

1.3.3在牙齿发育过程中表达的Wnt基因

1.4慢病毒载体

1.4.1 HIV-1慢病毒载体的结构特点

1.4.2慢病毒载体的基因结构及其特点

1.4.3 HIV-1慢病毒的生活史

1.4.4慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制

1.4.5 HIV-1慢病毒载体的构建

1.5 RNA干扰

1.5.1 RNA干扰技术的概念

1.5.2 RNA干扰技术的原理

1.5.3慢病毒载体介导RNA干扰

1.5.4 RNA干扰技术的应用

1.6本研究的目的和意义

第2章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株和载体

2.1.2细胞

2.1.3实验动物

2.1.4实验仪器与设备

2.1.5主要药品

2.1.6耗材

2.1.7试剂配制

2.1.8 Realtime PCR引物和探针

2.2方法

2.2.1慢病毒的生产

2.2.2 Realtime RT-PCR

2.2.3牙胚组织重组、病毒感染和器官培养

2.2.4形态学分析

第3章实验结果

3.1慢病毒的生产

3.1.1酶切鉴定pNL-EGFP-U6-shsFrp3-Ⅱ质粒

3.1.2三质粒共转染293T细胞，生产慢病毒

3.1.3病毒滴度的计算

3.1.4最佳MOI的确定

3.2标准曲线

3.2.1总RNA质量的鉴定

3.2.2 Realtime RT-PCR

3.2.3 sFrp3 mRNA含量标准曲线

3.3 sFrp3 RNAi对磨牙发育的影响

3.3.1 RNAi对sFrp3表达抑制的效率

3.3.2体外培养的组织学分析

3.3.3体内培养的组织学分析

3.3.4牙胚重组植块的组织学分析

第4章分析与讨论

4.1影响慢病毒转染效率的因素及MOI的确定

4.2 RNAi抑制sFrp3表达

4.3 RNAi抑制小鼠sFrp3的表达会促进牙齿发育加快

结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历