用M-PCR检测闽江流域表面水体中病原性大肠杆菌的毒素基因

摘要

大肠杆菌(Escherichia coli.)是人和温血动物肠内普遍存在的细菌，可分为病原性大肠杆菌和非病原性大肠杆菌。本文在文献综述中介绍了大肠杆菌毒素基因检测的研究进展以及多重PCR(Multiplex PCR)技术的发展和应用。本研究以闽江流域表体水面中分离出的大肠杆菌为材料，经膜过滤法(membrane filtration method)结合mFC—BCIG培养基的方法来分离粪大肠杆菌，并使用乳糖发酵培养基和磷酸盐葡萄糖胨水培养基来对其进行生化检测，最终确定单位体积水样中粪大肠杆菌的数量，然后将粪大肠杆菌菌株制成PCR模板同时甘油保存。 研究结果表明：对闽江流域从上游到下游7个断面进行了大肠杆菌的分离、鉴定和12种毒素基因的多重PCR检测。在鉴定的1231株粪大肠杆菌中检出10种毒素基因，其中具有扩散性黏附素(aidA—1)毒素基因的大肠杆菌占总数的12.99％，热不稳定肠毒素(elt)和热稳定肠毒素(astA)数量次之(分别占总数的5.8％和5.4％)，还检测出了少数高危菌株的主要致病因子，例如志贺氏毒素(Stx2e)和耐药性因子(sepA)等。 分别于不同季节在闽江流域福州过境段的洪山桥和解放大桥断面采取水样，进行大肠杆菌的分离、鉴定。用多重PCR方法对不同季节分离的大肠杆菌毒素基因的时空分布进行定性与定量分析。从分离的2015株粪大肠杆菌中发现840株潜在的致病性大肠杆菌，分别属于肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)。检出的10种毒素基因中，以扩散性黏附素基因(aidA—1)、热稳定性肠毒素基因(astA)和耐药性因子(sepA)为最多；细菌总量、大肠杆菌总数和致病性大肠杆菌总数在冬季较低，春季较多，夏秋季节达到全年数量的高峰；潜在的致病性大肠杆菌的毒素基因的种类和数量也是在冬季最少，春夏季上升，秋季最多。 使用多重PCR(multiplex PCR)的方法对粪大肠杆菌菌株中的毒素基因(virulence gene)进行检测，为闽江河的污染现状和风险评估提供科学依据和技术支撑。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

一、研究背景

二、文献综述

1大肠杆菌的生物学特性

2粪大肠杆菌的毒素基因

3致病性大肠杆菌的分子检测技术研究进展

三、本研究的目的和意义

四、本研究的技术路线

第一章 水体中粪大肠杆菌的分离、富集及生化分析

1.1前言

1.2实验材料

1.2.1水样以及水体中的大肠杆菌

1.2.2培养基以及常规试剂

1.2.3主要仪器

1.3实验方法

1.3.1水样的采集

1.3.2水体中粪大肠杆菌的分离和富集

1.3.3粪大肠杆菌的生化鉴定

1.4实验结果

1.4.1水体中粪大肠杆菌的分离

1.4.2水体中大肠杆菌的生化分析

1.4.3闽江流域7个端面取样情况和粪大肠杆菌的分离结果

1.4.4闽江流域福州段不同季节采样情况和粪大肠杆菌的分离结果

1.5讨论与小结

1.5.1水体中粪大肠杆菌的分离

1.5.2水体中粪大肠杆菌的生化分析方法

1.5.3闽江流域粪大肠杆菌数

第二章 多重PCR检测闽江流域致病性大肠杆菌毒素基因

2.1前言

2.2实验材料

2.2.1大肠杆菌菌株

2.2.2分子生物学试剂以及常规试剂

2.2.3主要仪器

2.3实验方法

2.3.1大肠杆菌阳性对照菌株DNA的提取

2.3.2多重PCR反应模板的制备

2.3.3多重PCR检测大肠杆菌毒素基因的引物

2.3.4 12种毒素基因的多重PCR扩增

2.3.5 12种毒素基因多重PCR扩增的反应参数：

2.3.6琼脂糖凝胶电泳

2.4实验结果

2.4.1大肠杆菌阳性对照菌株DNA的提取

2.4.2闽江流域水样中含毒性基因大肠杆菌的定性与定量

2.4.3含毒性基因大肠杆菌分离物的分型与鉴定

2.4.4 elt基因和sepA基因的扩增与胶回收结果

2.4.5基因测序与同源性比较

2.4.6含毒素基因大肠杆菌分离物的毒性类型与分布

2.5讨论与小结

2.5.1闽江流域大肠杆菌毒素基因的多重PCR检测

2.5.2大肠杆菌毒素基因的分型与分布

第三章 多重PCR检测闽江流域福州段致病性大肠杆菌毒素基因

3.1前言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4实验结果

3.4.1闽江流域福州段致病性与非致病性大肠杆菌的数量

3.4.2基因测序与同源性比较

3.4.3闽江流域福州段大肠杆菌的毒性类型

3.4.4毒素基因的种类与分布

3.5讨论与小结

第四章 结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历