直接发酵法生产L-色氨酸的研究

摘要

本文以谷氨酸棒杆菌FC22为出发菌株，对直接发酵法生产L-色氨酸进行了研究。主要研究内容和结果如下： 1.采用对二甲氨基苯甲醛比色法对发酵液中的L.色氨酸含量进行了定量分析。对比色法中影响L-色氨酸含量测定的因素进行了研究，并用单因素试验优化了实验条件，得出了对二甲氨基苯甲醛比色法测定L-色氨酸含量的最佳检测条件，从而建立了快速测定发酵液中L-色氨酸含量的方法。在最佳检测条件下，L-色氨酸含量在0～150 mg/L浓度范围内线性关系良好，回归方程为A593nm=0.0053C-0.0007，相关系数为R2=0.9975，回收率为98.5％-99.0％。 2.对出发菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)FC22的形态特征和生理特性进行初步鉴定和分析，对该菌株的发酵培养基配方及发酵条件进行研究，确定了发酵过程中影响L-色氨酸积累的主要因素，从而为诱变育种的筛选工作做了准备。 3.以谷氨酸棒状杆菌FC22(Phe-+Tyr'+5MTR)为出发菌株，经紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理，并采用磺胺胍(SG)、肉桂酸(CIN)作为抗性药物，通过摇瓶初筛和复筛、单菌落分纯以及连续传代试验测定，定向选育出一株遗传性状稳定的L-色氨酸高产菌株FC1013(Phe-+Tyr+5MTR+SGR+CINR)，在未经优化的发酵条件下摇瓶培养3天，平均可积累L-色氨酸8.91 g/L，比出发菌株FC22产量提高了120％。 4.研究了菌株FC1013的摇瓶分批发酵条件。采用正交设计试验法优化了种子培养基组成配比；采用响应面分析试验法优化了发酵培养基组成配比；采用单因素试验优化了发酵培养条件。在优化条件下，菌株FC1013摇瓶发酵72小时，平均可积累L-色氨酸9.79 g/L，比出发菌株FC22提高了141.7％。

目录

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声明

第1章绪论

1.1 L-色氨酸的理化性质

1.2 L-色氨酸的用途

1.2.1 L-色氨酸在医学上的应用

1.2.2 L-色氨酸在食品和饲料添加剂中的应用

1.3 L-色氨酸的生产方法

1.3.1蛋白质水解法和化学合成法

1.3.2微生物法

1.3.3代谢工程技术在L-色氨酸生产菌种选育中的应用

1.4 L-色氨酸生产菌代谢控制育种的研究

1.4.1.L-色氨酸的生物合成途径及调节机制

1.4.2代谢控制育种思路

1.5论文的立题背景及主要研究内容

第2章发酵液中L-色氨酸的定性定量测定

2.1前言

2.2实验材料

2.2.1主要仪器

2.2.2主要试剂

2.2.3相关溶液

2.3实验方法

2.3.1.L-色氨酸的定性测定-纸层析法

2.3.2 L-色氨酸的定量测定

2.4结果与讨论

2.4.1 L-色氨酸的定性测定

2.4.2比色法测定中波长的选择

2.4.3比色法中显色条件的影响

2.4.4比色法中试剂用量的影响

2.4.5标准曲线的绘制

2.4.6干扰试验

2.4.7回收率的测定

2.5本章小结

第3章出发菌株某些特性及发酵试验的研究

3.1前言

3.2实验材料

3.2.1菌种

3.2.2主要仪器

3.2.3主要试剂

3.2.4相关溶液

3.2.5培养基

3.3实验方法

3.3.1菌体生长曲线的测定

3.3.2摇瓶发酵培养方法

3.3.3分析方法

3.4结果与讨论

3.4.1菌体形态特征及生理特性观察

3.4.2菌体生长曲线的绘制

3.4.3营养对L-色氨酸产量的影响

3.4.4环境因素对生产L-色氨酸的影响

3.5本章小结

第4章L-色氨酸高产菌株的诱变选育

4.1前言

4.2实验材料

4.2.1菌种

4.2.2主要仪器

4.2.3主要试剂

4.2.4相关溶液

4.2.5培养基

4.3实验方法

4.3.1菌浓的测定

4.3.2单细胞悬浮液的制备

4.3.3紫外线诱变

4.3.4 DES诱变

4.3.5抗药性菌株的筛选

4.3.6高产色氨酸菌株的筛选

4.3.7分析方法

4.4结果与讨论

4.4.1对数生长后期菌浓的测定

4.4.2诱变条件的选择

4.4.3抗性药物的选择

4.4.4 L-色氨酸产生菌FC1013选育谱系

4.4.5磺胺胍抗性菌株的筛选

4.4.6肉桂酸抗性菌株的筛选

4.4.7 FCl013遗传稳定性测定

4.5本章小结

第5章L-色氨酸摇瓶分批发酵条件的研究

5.1前言

5.2实验材料

5.2.1.菌种

5.2.2主要仪器

5.2.3主要试剂

5.2.4相关溶液

5.2.5培养基

5.3实验方法

5.3.1.培养方法

5.3.2分析方法

5.3.3种子生长曲线绘制

5.4结果与讨论

5.4.1种子培养基优化

5.4.2种子培养时间的确定

5.4.3接种量对产酸的影响

5.4.4发酵培养基的优化

5.4.5摇瓶发酵培养条件的优化

5.4.6各种营养物质对FC1013发酵积累L-色氨酸的影响

5.4.7 L-色氨酸发酵过程曲线

5.5本章小结

第6章结论与展望

6.1总结

6.2 展望

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢