酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6突变株的构建及hxt1基因的过表达

摘要

生物质能源是化石能源良好的替代品，乙醇作为比较理想的可再生液体燃料备受国内外科学家的亲睐。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为传统乙醇生产主要用菌，选育其高产菌株一直是燃料乙醇生产的关键因素。其中，应用重组DNA和分子改造技术有目的地改变酵母表达调控网络和已有代谢途径，优化细胞代谢机制，构建优良性状工业微生物显得尤为重要。 本研究依据酿酒酵母本身高效的同源重组机制，应用过表达和基因敲除技术，增强合成底物代谢利用率，降低或阻遏乙醇分解代谢流，成功构建双基因缺失突变菌株YS2-△aadh2-△ald6和过表达己糖转运蛋白基因hxt1的YS2-△adh2-△ald6-hxt1突变株。取得以下研究进展： 1、以adh2基因缺陷型酿酒酵母YS2一△adh2为出发菌株，应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建ald6基因敲除组件，转化酿酒酵母YS2-△adh2进行同源重组，之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中，半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记，最后，传代丢失质粒pSH65获得双倍体ald6基因缺失突变株YS2-△adh2-△ald6。发酵试验表明与出发菌株YS2相比，突变株乙酸合成量降低18％，乙醇最高产量提高12.5％。生理特性试验表现为突变株具有很高的遗传稳定性，生长情况不受影响。 2、在pSH47质粒的基础上，通过设计分别带有EcoR I酶切位点引物将hxt1 ORF与截短的hxt7启动子融合到CYC1终止子的上游区域。随后将pUG6载体上的Kanr抗性基因片段连接到pSHG17载体上，构建了整合表达载体pSHGK17。转化酵母突变株YS2-△adh2-△Aald6，经G418抗性筛选、PCR验证得到过表达hxt1基因突变株YS2-△adh2-△ald6-hxt1。生长方面突变株迟滞期稍长，指数生长中后期菌浓上升较快，其他方面没有显著差异，遗传稳定性高。发酵检测，突变株YS2-△adh2-△ald6-hxt1与YS2-△adh2-△adh6和YS2菌株相比，糖代谢加快，发酵周期分别提前了3小时和8小时；乙醇产量较YS2菌株提高了12.65％。 在化石能源储量日趋减少，环境污染问题日益加剧，能源需求和石油价格持续上涨的背景下，世界各国都在积极开发利用可再生的绿色清洁能源。燃料乙醇以其污染小、经济可行、原料来源广泛等特点作为目前大规模替代石油的可再生能源，受到国内外普遍关注。在我国，开发利用新能源和可再生能源，已成为调整和优化能源结构、解决环境污染问题的国家战略。目前，燃料乙醇研究可分为三大类：菌种选育研究、发酵工艺研究、特殊需要的基因工程菌构建。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)做为传统的乙醇生产菌株，具有乙醇耐受性强，发酵工艺成熟，工业应用范围广泛，与其它微生物比较生物安全性好等特点。同时，酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，遗传背景非常清楚，由于其体内具有高效的同源重组机制，在分子和基因水平进行操作非常容易。在实际工业生产中，为了降低发酵工艺成本、实现高效的转化率和产出率，菌种的优劣在整个生产流程中尤为重要。因此，菌种的选育必须以降低生产耗资与高产出为原则。近年来，依据代谢工程理念，应用分子生物学手段对酿酒酵母进行分子育种是主要的研究方向，其中，尤为突出的是重组DNA技术。应用代谢工程理念使用基因工程手段对菌种改造过程中，敲除或过表达特定基因可以阐明该基因功能，改变代谢途径，从而提高目标产物产量。同时，该突变株为进一步探索目的基因的转录调控机制、基因与蛋白质相互作用以及分子信号传导通路等提供了理想材料，并为进一步从基因和分子水平改进酿酒酵母乙醇代谢途径，构建优良性状高产乙醇生产菌奠定了基础。本研究利用酿酒酵母细胞内的同源重组机制，运用基因敲除和过表达技术，降低了由乙醛生成乙酸的分解代谢流，并在此基础上增强了己糖代谢率。与原始出发菌株相比，不仅提高了乙醇产量，而且缩短了发酵周期，提高了发酵产率。研究内容如下： (1)酿酒酵母主要有五个编码乙醇脱氢酶基因：adh1、adh2、adh3、adh4、adh5，其中Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p五个乙醇脱氢酶在代谢中执行还原乙醛生成乙醇功能，而乙醇脱氢酶Adh2p其生物学功能却催化乙醇生成乙醛。本工程中心利用基因敲除技术成功构建了adh2基因缺陷型突变株，该菌株在发酵后期乙醇合成代谢稳定，乙醇分解利用率低于出发菌株。乙醛脱氢酶VI(ald6)是乙醛脱氢酶家族ACDH的一种，其基因编码乙醛脱氢酶Ald6p，执行生物催化乙醛至乙酸的生物学功能，是糖酵解过程中乙酸发酵的关键酶。在酿酒酵母adh2基因缺失基础上敲除ald6基因，有望降低乙醛至乙酸分解代谢流，从而使更多的乙醛转化生成乙醇。 本研究采用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)方法构建ald6基因敲除组件。首先设计引物合成目的基因的上下游同源片段和pUG6质粒上面带有Kanr基因筛选标记的两个loxP位点片段。扩增ald6基因上游同源片段反向引物的5'端序列与扩增筛选标记正向引物序列是反向互补的，同样，扩增ald6基因下游同源片段正向引物的5'端序列与扩增筛选标记反向引物序列是反向互补的。随后将扩增得到的三个片段运用重叠延伸PCR合成带有Kanr筛选标记的基因敲除组件。采用醋酸锂高效率转化方法转化酿酒酵母adh2基因缺陷型菌株YS2-△adh2，与ald6基因序列发生同源重组，用G418抗性筛选克隆子，采用PCR验证得到阳性克隆子。随后转化带有腐草霉素筛选标记的pSH65质粒到阳性克隆中，半乳糖诱导表达Cre重组酶，切除两个loxP位点片段中间的Kanr筛选标记基因序列，最后在原来目的基因位点处只留下一个loxP位点。采用相同的技术和步骤敲除ald6的等位基因，最终获得双基因缺陷型菌株YS2-△adh2-△ald6。 原始菌株YS2、单基因缺失菌株YS2-△adh2和双基因缺陷型菌株YS2-△adh2-Aald6相比，双基因的缺失对细胞生长没有影响，细胞形态相似，而且遗传稳定性高。发酵检测突变株YS2-△adh2-△ald6乙醇合成量比YS2-△adh2提高了6.9％，比YS2提高12.5％，且乙酸产量较YS2降低了18％。YS2-△adh2-△ald6突变株的生物学效应说明了adh2和ald6基因在乙醇的合成代谢过程中起着一定的调节作用。 本研究设计了长侧翼同源PCR(LFH-PCR)结合Crc/loxP系统敲除了ald6基因，这种方法可以得到几百bp左右侧翼同源区域，大大提高了同源重组效率，缩减了筛选工作量。本研究采用的技术和方法为其他物种的长侧翼同源基因敲除提供了参考。利用Cre/loxP系统介导的标记挽救可以在同一菌株连续多次使用相同的抗性标记，有效解决了野生型工业酵母多基因敲除时筛选标记有限的难题。 (2)由于酵母本身不具备完善的己糖转运系统，在酿酒工业生产中经常出现缓慢和不完全的乙醇发酵现象。葡萄糖在己糖转运蛋白的作用下进行跨膜运输是酿酒酵母发酵代谢的控制点。在酿酒酵母细胞中，己糖转运蛋白家族(HXT)包括20多个具有不同葡萄糖亲和力的转运蛋白。如果细胞中缺少这些己糖转运蛋白，葡萄糖的消耗和运输几乎完全终止。Hxt1-hxt4，还有hxt6、hxt7是主要的葡萄糖转运基因。高浓度葡萄糖会抑制编码高亲和力和中等亲和力的葡萄糖转运基因的表达，同时，低亲和力葡萄糖转运基因被诱导表达。Hxt1p作为最主要的转运蛋白之一，在高浓度葡萄糖介质中(>1％w/v)被诱导表达。5'端缺失只留有编码区ATG上游390 bp的hxt7启动子序列具有很强的转录活性，在乙醇和葡萄糖介质中可以形成组成型表达。在本研究当中，通过构建整合表达载体pSHGK17将hxt1 ORF与截短的hxt7启动子融合，转化酿酒酵母adh2，ald6双基因缺失突变株YS2-△adh2-△ald6进行同源重组，增强Hxt1p的表达量。 首先设计分别带有EcoR I和Sal I酶切位点的引物扩增hxt1基因，然后连接到经EcoR I和Sal I双酶切后的pSH47载体上，且将hxt1基因置于CYC1终止子的上游，构建载体命名为pSHG1。随后用分别带有Sac I和EcoR I酶切位点的引物扩增hxt7启动子序列，连接到经Sac I和EcoR I双酶切的pSHG1载体上，构建载体命名为pSHG17。为了增加转化酵母后的抗性筛选标记，用PvuII和EcoR V双酶切pUG6载体上的Kanr筛选标记片段，连接到经EcoR V单酶切的pSHG17载体上，构建整合表达载体为pSHGK17。最后用EcoR V单酶切pSHGK17载体，转化酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6进行同源重组，用G418筛选克隆子。然后用PCR验证得到阳性克隆子，构建酿酒酵母突变株命名为YS2-△adh2-△ald6-hxt1。 在生长方面，过表达hxt1突变株YS2-△adh2-△ald6-hxt1迟滞期略长，在指数生长中后期生物量增长较快，具有很高的遗传稳定性。通过发酵检测，过表达hxt1突变株YS2-△adh2-△ald6-hxt1与双基因缺陷型菌株YS2-△adh2-△Aald6和原始出发菌株YS2相比，耗糖快，发酵周期分别提前了3小时和8小时，乙醇产量较YS2提高了12.65％。构建成功的突变株YS2-△adh2-△ald6-hxt1是一株具有潜力的乙醇生产菌。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

1.课题背景

2.理想的燃料乙醇生产菌--酿酒酵母

2.1 酿酒酵母生活史

2.2 酿酒酵母基因组

2.3 在科学研究中的作用

3.酿酒酵母基因工程菌构建研究进展

3.1 菌种选育

3.2 发酵工艺优化

3.3 特殊需要的基因工程菌构建

4.基因敲除技术在构建酿酒酵母基因工程菌中的应用

4.1 利用同源重组达到基因敲除

4.2 以PCR方法为基础的基因敲除组件的构建

4.3 基因敲除技术展望

5.基因过表达技术的应用

5.1 酵母表达的启动子

5.2 酵母表达载体系统

6.乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶关键基因分析及在发酵过程中的作用

6.1 乙醇脱氢酶

6.2 乙醛脱氢酶

7.酿酒酵母己糖转运蛋白

8.本研究立题依据与意义

第1章 酿酒酵母 adh2 ald6双基因缺失突变株的构建

1.材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2.实验结果

2.1 YS2-△adh2基因组DNA的提取

2.2 ald6基因的PCR验证

2.3 质粒DNA的制备

2.4 基因敲除组件的构建

2.5 突变株的转化、筛选及验证

2.6 Kanr筛选标记的去除和验证

2.7 筛选标记重复利用敲除另一条等位基因

2.8 突变株的生理特性试验

3.讨论

第2章 Hxtl基因在adh2、ald6双基因缺失突变株的过表达

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.实验结果

2.1 hxt7启动子和hxt1基因片段的扩增

2.2 pSHG1载体构建

2.3 pSHG17载体构建

2.4 pSHGK17载体构建

2.5 过表达载体pSHGK17转化酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6菌株

2.6 突变株的生理特性试验

3.讨论

第3章 结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历