苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）几丁质酶基因的克隆、表达及其工程菌的构建

摘要

从该室保存的Bacillus thuringiensis(Bt)菌株中,筛选出几丁质酶高产菌株WB-7.根据已经在GenBank上登录的Bt几丁质酶基因序列设计1对引物QCL1/QCL2,用PCR方法扩增出的几丁质酶全长基因,将PCR产物直接连接到pMD-18T克隆载体上转入E.coli DH5α中克隆得到2025bp包含氨基酸全序列的几丁质酶基因,并命名为Chi7,在GenBank上的登录注册号为AY074882.利用Blast软件进行该基因的同源性分析,结果表明:chi7基因与已知的Bt和Bc几丁质酶基因都有90％以上的同源性;而与其它细菌的几丁质酶基因同源性不高,如与Bacillus subtilis、Bacillus circulans的几丁质酶基因的同源性分别为50％、52％的.将chi7基因序列翻译为Chi7蛋白质氨基酸序列,该基因编码674个氨基酸残基.利用蛋白质分析软件对Chi7蛋白进行功能结构和空间结构分析,结果表明:经在线的Smart软件进行氨基酸的序列分析,推导出的Chi7蛋白质一级结构功能域包含有:7-26信号肽区、ChiA几丁质酶催化区、485-557类纤连蛋白Ⅲ型区、579-672几丁质结合区4个结构功能域;经跨膜区分析在线软件TMHMM2.0分析,表明Chi7蛋白前端的信号肽是跨膜信号,同时SignalP分析也表明:Chi7蛋白的成熟加工剪切位点在第32-33的Ala-Asp间.用在线蛋白质分析软件ExPASy Proteomics tools进行chi7蛋白结构分析,结果表明:在氨基酸残基200-300间有可能存在coiled coil区域,整个蛋白质中没有亮氨酸拉链结构;在蛋白的二级结构中有19.56％的螺旋结构、25.78％的折叠结构、54.67％的成环结构;整个蛋白质的三维结构呈紧密的球状.构建pBluescript SK原核表达载体在E.coli中检测到Bt几丁质酶活性,但是表达的Bt几丁质酶活性不高.将Bt chi7基因连接到枯草芽孢杆菌(Bs)表达载体pUS186,电激转化到Bs菌株QB1098中筛选重组质粒pUS-chi7.将重组质粒pUS-chi7电激转化到Bs受体菌株BS-2中,用PCR检测重组质粒pUS-chi7是否导入,最后筛选得到5株含有Bt几丁质酶基因BS-2工程菌.

目录

前言

1苏云金芽孢杆菌

1.1研究历史

1.2血清学分类

1.3作用机制和范围

1.4工业化生产

2几丁质

3几丁质酶

3.1研究历史

3.2微生物几丁质酶

4微生物几丁质酶生物防治应用的生物学研究

4.1几丁质酶的杀虫增效作用

4.2几丁质酶防治真菌病害研究

4.3几丁质酶在医学上的应用

5本研究的目的和意义

几丁质酶基因的克隆和表达

1材料与方法

1.1菌株

1.2培养基

1.3总DNA的提取

1.4总DNA的定性定量

1.5 PCR扩增

1.6琼脂糖凝胶电泳分析

1.7大肠杆菌感受态细胞的制备

1.8克隆载体构建

1.9转化和筛选

1.10碱裂解法提取E.coli质粒

1.11克隆重组质粒酶切分析

1.12测序

1.13从琼脂糖凝胶中回收核酸

1.14chi7基因原核表达载体构建

1.15表达重组质粒的酶切分析

1.16原核表达的检测

2结果与分析

2.1菌株产几丁质酶测定

2.2WB-7几丁质酶基因的PCR扩增

2.3几丁质酶基因的克隆

2.4序列测定

2.5核酸同源性分析

2.6推导出的蛋白质结构功能分析

2.7原核表达载体的构建

2.8原核表达的几丁质酶活性检测

3讨论

3.1 Bt是一个独立的种?

3.2原核表达的菌株选择

3.3几丁质酶活性的检测方法

3.4下一步工作

枯草芽孢杆菌工程菌构建

1材料与方法

1.1菌株

1.2培养基

1.3总DNA的提取

1.4总DNA的定性定量

1.5碱裂解法提取Bs质粒

1.6琼脂糖凝胶电泳分析

1.7Bs表达载体构建

1.8从琼脂糖凝胶中回收核酸

1.9电激感受态的制备

1.10电激

1.11转化和筛选

1.12表达重组质粒的酶切分析

1.13PCR验证

2结果与分析

2.1重组质粒pUS-chi7鉴定

2.2重组质粒导入目的菌株的鉴定

3 讨论

3.1 pUS186质粒载体的改造

3.2下一步工作

参考文献

发表论文

致谢