花生脂肪酸品质改良关键基因FAD2的克隆与特异表达载体构建

摘要

花生是世界第四大油料种子作物，在全世界范围内的热带和亚热带地区种植。中国是世界上生产花生最多的国家之一。决定食用植物油品质的一个主要因素是脂肪酸的构成。花生油主要含有油酸和亚油酸，油酸能降低人体内低密度脂蛋白胆固醇(LDL)含量，同时并不会降低高密度脂蛋白胆固醇(HDL)；而含亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸高的植物油会同时降低LDL、HDL。现有的品种中油酸与亚油酸的比值偏低，因此提高花生油中油酸的含量已成为世界花生品质改良的主要方向。为了改良花生的油酸组成，本研究采用了分子生物学、生物信息学技术和基因工程手段研究了花生的油酸改良。通过同源克隆途径分别克隆了油酸脱氢酶基因的编码区及片段，同时克隆了胚特异表达启动子，通过酶切和连接构建了胚特异表达FAD2的反义RNA植物表达载体和RNAi的中间表达载体；并通过冻融法将植物表达载体转化农杆菌，并用于遗传转化研究。其主要结果如下： 1.为了使目的基因在花生胚中特异表达，根据网上已发表的序列信息合成引物，分别利用PCR技术从大豆中分离得到油体蛋白基因oleosin的启动子和β-伴球蛋白α亚基的启动子(7S)，；从油菜中分离得到油菜1.7Snapin种子贮藏蛋白(napA)基因的启动子(2S)；从胡萝卜中分离得到胡萝卜Lea族基因Dc3的启动子(Dc3)。将7S、2S和Dc3启动子构建到克隆载体pGM-T中，并进行测序，oleosin启动子构建到中间表达载体pSPROK中，并进行了测序鉴定。测定结果表明：7S启动子的长度为878bp，与GenBank上引用的序列的同源性为99.8％；2S启动子的长度为1145bp，与GenBank上引用的序列的同源性为100％;Dc3启动子的长度为153bp，与GenBank上引用的序列的长度为100％;启动子oleosin-a与oleosin-b的长度分别为595bp和319bp，与GenBank上引用的序列的同源性为分别为97％和96％。 2.从花生中提取基因组DNA，根据GenBank上发表的△12脂肪酸脱氢酶基因的序列来设计引物，利用PCR技术从花生叶片中分离得到了两个不同长度的目的片段：FAD2-1和FAD2-2，然后与大豆油体蛋白基因oleosin的启动子相连，先构建在pSPROK中间表达载体上，进而构建到植物表达载体pCAMBIA1300中，已得到三个反义RNA表达载体，分别命名为pCAMBIA1300-2a、pCAMBIA1300-2b和pCAMBIA1300-1a。测序表明，FAD2-2已经插入到植物表达载体pCAMBIA1300中，该片段长度为593bp，含有一个558bp的编码区，编码186个氨基酸，与已报道的序列具有97％的同源性；FAD2-1已经插入到植物表达载体pCAMBIA1300中，该片段长度为1175bp，含有一个1140bp的编码区，编码380个氨基酸，与已报道的序列具有99％的同源性；目前这三个表达载体已转化农杆菌LBA4404，并对花生进行了遗传转化研究。 3.分别从花生叶片中分离得到了△12脂肪酸脱氢酶基因的四个目的片段，长度为200bp和400bp。构建到中间表达载体pKANNIBAL中，获得了两个ihpRNA中间表达载体。编号分别为pKANNIBAL-Ⅰ+Ⅱ和pKANNIBAL-Ⅲ+Ⅳ。这两个中间表达载体己在网上登录，登录号为DQ462470和DQ462471。 总之，通过本研究我们共构建了3个FAD2的反义RNA植物表达载体，2个ihpRNA的中间表达载体，这为之后通过遗传转化，改良花生的脂肪酸组成奠定了前期工作基础。

目录

论文说明：本文缩写词表

独创性声明及论文使用授权的说明

第一章引言

第二章几种种子特异性表达启动子的克隆和测序

第三章花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建和转化

第四章花生Δ 12脂肪酸脱氢酶基因ihpRNA中间表达载体的构建

参考文献

附录一

附录二

附录三

致谢