番鸭源禽1型副粘病毒P基因克隆及原核表达

摘要

禽1型副粘病毒(Avian paramyXOVirus type 1， APMV-1)是副粘病毒科副粘病毒亚科禽腮腺炎病毒属的成员，是危害养禽业最为严重的传染病病原之一，其代表毒株为新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)。其引起的疫病——新城疫被世界动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病，因此其病原的研究也成为禽病研究的重点和热点。 2002年以来，我国浙江、福建等省份部分地区8～40日龄的番鸭发生一种以表现神经症状、呼吸困难、腹泻为主要临床特征的疫病，发病率高达52％，病死率高达30％，经病毒分离鉴定和人工感染试验确定为APMV-1感染。 本实验根据GenBank中水禽源禽1型副粘病毒(ZJl)P基因序列设计2对引物，运用RT-PCR技术从福建分离的1株番鸭源APMV-1 (FP1/02株)的基因组中扩增出P全基因的cDNA。测序结果表明，P基因全长1441nt，包含一个完整的开放阅读框架，编码395个氨基酸，通过Genebank的Blast比对分析，有40多株病毒P基因序列同源性较高(同源性在80％以上)，其中与PX2/03株、ZJ1株和SF02株的同源性最高，达97％。同时借助生物学软件及相关在线分析工具对测序完成的P基因进行基于氨基酸序列的生物信息学分析，包括蛋白质理化特性、蛋白质功能域、基序、空间结构等，分析表明P蛋白无信号肽、卷曲螺旋等功能区特征。 以测序正确的P基因为模板，用分别含EcoRI、XhoI的一对引物对该目的基因进行亚克隆后插入到pGEX-5X-1原核表达载体中。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸序列分析，结果表明所插入的阅读框正确，序列无误，从而成功地构建了pGEX-5X-1/P原核表达载体。 将测序正确的重组质粒pGEX-5X-1/P分别转化E．coli BL21(DE3)宿主菌，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳结果表明pGEX-5X-1/P在E．coli BL21(DE3)获得了高效表达，在相应位置上(68KD处)可见明显的目的蛋白表达带；重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达；GST亲和层析纯化收集蛋白，纯化后的蛋白经Western-blot和ELISA初步鉴定能与鸭源禽1型副粘病毒P蛋白阳性血清发生特异反应。本试验成功地克隆了FP1/02株番鸭源APMV-1 P基因完整片段，并实现了其在原核表达系统中的高效表达。本试验结果为研究番鸭源APMV-1 P基因编码的各蛋白对不同宿主的免疫原性及在APMV-1跨种间致病等方面的作用和禽1型副粘病毒基因工程疫苗、新型诊断试剂的研制奠定基础。

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文摘

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论文说明：缩略词表

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第一部分禽1型副粘病毒研究动态

引言

1禽1型副粘病毒——新城疫病毒概述

1.1新城疫病毒分类地位与形态、结构

1.2新城疫病毒生物学性质

1.3新城疫病毒流行病学特点

1.4新城疫病毒临床症状与剖检病变

1.5新城疫病毒分子生物学

1.6新城疫病毒致病力的分子基础

1.7新城疫病毒分子诊断技术

2水禽感染禽副粘病毒的研究进展

2.1鸭感染禽副粘病毒

2.2鹅感染禽副粘病毒

2.3其他水禽感染禽副粘病毒

3研究的目的和意义

第二部分研究内容

第1章番鸭源禽1型副粘病毒P基因的克隆与测序

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

第2章番鸭源禽1型副粘病毒P基因的生物信息学分析

1实验方法

2结果与分析

3讨论

第3章番鸭源禽1型副粘病毒P基因的原核表达及其产物的纯化鉴定

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢

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