利用RNA干扰技术抑制四九菜心中黑芥子酶基因的表达

摘要

黑芥子酶-硫代葡萄糖苷系统是十字花科植物(包括拟南芥和芸苔属植物)防御植食性昆虫和病原菌侵害的主要化学防御系统，也被称作“芥子油炸弹”。对于可利用的抗虫种质资源相对较少的菜心(Brassica parachinensis Bailey)来说，如何充分利用这个有效的防御系统是解决菜心抗虫育种的关键。充分了解该防御系统的作用机理，有助于应用这个防御系统开展抗虫育种工作。 本研究利用RT-PCR技术从四九菜心总RNA中扩增出890bp的黑芥子酶基因片段MY，并把它们正反插入到载体pJM007的内含子两侧，形成一个MY(RNAi)元件，经PstⅠ酶切并克隆到植物表达载体pCAMBIA1301，形成pCAMBIA1301+MY(RNAi)载体。经酶切及序列测定证实，成功地构建了黑芥子酶基因反向重复结构的RNAi植物表达载体。通过冻融法把pCAMBIA1301+MY(RNAi)载体转移到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101中。利用带有pCAMBIA1301+MY(RNAi)载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101，侵染四九菜心无菌苗的子叶--子叶柄，经过潮霉素筛选获得转基因植株。经过PCR检测和Southern杂交验证，获得4个转基因再生株系。提取转基因植株和正常植株的总RNA，经Northern杂交验证，转基因植株中黑芥子酶基因的表达被有效地抑制。 同时，我们还研究了诱导培养基中12种不同量组合的6-BA和NAA对菜心离体植株再生频率的影响，并探讨了适宜四九菜心转化的潮霉素筛选浓度。最终，初步建立了一套适合四九菜心遗传转化的体系。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 前言

1.1硫代葡萄糖苷（Glucosinolates）

1.2黑芥子酶及其性质

1.2.1黑芥子酶的分布

1.2.2黑芥子酶基因家族

1.2.3黑芥子酶复合体

1.2.4黑芥子酶的结构及其活性的影响因素

1.3黑芥子酶-硫代葡萄糖苷系统在植物中的防御作用

1.4本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1质粒与菌种

2.1.2供试蔬菜

2.1.3生化试剂与酶类

2.1.4其他试剂及溶液

2.1.5主要培养基配置

2.1.6主要仪器设备

2.2方法

2.2.1四九菜心总RNA的提取

2.2.2四九菜心基因组DNA的提取

2.2.3总RNA和总DNA的定性定量

2.2.4第一链cDNA的合成

2.2.5引物设计与合成

2.2.6琼脂糖凝胶电泳分析

2.2.7琼脂糖凝胶上DNA片段的回收

2.2.8大肠杆菌感受态的制备

2.2.9 DNA片段的连接及转化

2.2.10大肠杆菌质粒DNA的提取

2.2.11根癌农杆菌GV3101感受态的制备

2.2.12冻融法介导的质粒转化根癌农杆菌

2.3 RNA干扰载体的构建

2.3.1目的基因的获得

2.3.2克隆载体的构建

2.3.3植物表达载体的构建

2.4四九菜心遗传转化体系的构建

2.4.1无菌苗的获得

2.4.2外植体的选择与培养

2.4.3诱导培养基的选择

2.4.4潮霉素筛选浓度的确定

2.4.5用于侵染外植体的根癌农杆菌菌株的准备

2.4.6外植体的转化与筛选

2.5转基因植株的分子生物学鉴定

2.5.1PCR检测

2.5.2 Southern杂交

2.5.3 Northern杂交

3结果与分析

3.1黑芥子酶基因片段MY的克隆

3.2克隆载体的酶切验证与PCR检测

3.3植物表达载体的酶切验证

3.4四九菜心遗传转化体系的优化

3.4.1诱导培养基的筛选

3.4.2潮霉素筛选浓度的确定

3.5转基因植株的分子检测

3.5.1转基因植株PCR检测

3.5.2转基因植株的Southern杂交检测

3.5.3转基因植株的Northern杂交检测

4讨论

4.1 RNAi技术在植物功能基因研究中的应用

4.2四九菜心遗传转化体系的优化

4.3黑芥子酶-硫代葡萄糖苷防御系统

4.4需继续开展的研究

参考文献

附 录

致 谢