IL-18和IL-18BP融合蛋白在不同载体中的表达和纯化

摘要

白细胞介素18是白细胞介素1家庭的一位独特的家族成员。它与白细胞介素1在结构上很相似，都是需要caspase-1才能使之前体变成有活性的因子。IL-18作为一种细胞因子可以诱生IFN-γ、增强NK细胞细胞毒性作用、增强NK细胞活性、增强Th1型免疫反应、抗肿瘤作用等多种生物功能。白介素18结合蛋白(IL-18BF)是新近发现的一种糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，目前已发现有6种IL-8BP的同工蛋白。IL-18BP可以在体内外有效抑制IL-18的作用，因而被认为是IL-18的天然拮抗剂。以往对IL-18和IL-18BP的研究分析只限于某个载体，没有专门针对原核系统、没有专门为了获取融合性蛋白而进行的。也没有在诱导表达和纯化的过程中，对IL-18和IL-18BP这两个天然拮抗剂进行专门的统一的分析，没有把他们的缓冲环境、融合蛋白诱导条件和洗杂、洗脱环境总结为共同的一个模式。IL-18和IL-18BP都存在于动物体内，因此对同一环境下的研究就显得十分有意义。本次实验对原核系统进行了表达和纯化，并以获得融合蛋白为目的，不断的探讨能够表达出融合蛋白的方法，同时对IL-18和IL-18BP表达、纯化条件进行比较，是一个纵向从PCR到纯化，横向从IL-18到IL-18BP的新的研究方法。它们在结构上虽然有一定程度的相似。但是还是相差很远，对它们表达和纯化的共同模式的摸索可能对它们作用机理、在动物体内的相互作用制衡的研究提供帮助。IL-18BP是IL-18的天然拮抗剂，由于他们都具有免疫的双向调节作用，所以在疾病的过程中通过两者的平衡，到达治疗和预防疾病的作用，那么本次实验的研究可能会对二者在共同的环境一动物体内平衡的研究具有一定程度上的意义。同时也将为基础兽医学和兽医免疫学提供新的科学研究依据，产生重要的影响。 实验研究采用PCR扩增出人白细胞介素18和人白细胞介素18结合蛋白的DNA，克隆到原核表达载体PET28a和Pgex-6p-1中，转化大肠杆菌BL21，在原核系统(BL21)中表达并纯化人白细胞介素18和白细胞介素18结合蛋白。探讨了PCR、酶切、连接、转化、诱导表达和纯化方面的实验过程和注意事项，从而展示了原核表达系统从PCR到纯化更加清晰的思路，同时也对蛋白序列进行了一定的分析，通过分析得出消光系数等数据，再同层析系统所提供的数据结合，计算出了蛋白的浓度，最后将蛋白进行浓缩，保存在-80℃。也从菌中提取了重组质粒，保存起来，以便日后方便使用。 实验运用gene runner软件设计好了引物，根据基因的特点和性质，选择了BamH I和EcoRI两个酶切位点，因为它们有共同的缓冲环境，进而确定了PET28a和Pgex-6p-1作为载体。根据菌体的性质，优化了质粒提取的效率。实验为了提高连接的效率，采用过夜连接，确保连接的成功。转化过程避开了震动，热击时间过长等一系列的干扰因素，使得实验能够顺利进行。诱导表达时严格控制时间，菌液的OD值等，避免了表达过程可能丢失重组质粒、噬菌体干扰，其他菌类的滋长等情况的发生。对于最佳的诱导浓度的摸索，采用了纵横交叉的梯度摸索，尽可能的找到诱导出融合蛋白的条件。为了避免在上层析系统时RNA对吸收峰的影响和蛋白的降解，事先在缓冲液中加入了RNA酶和还原剂。根据层析系统所得到的信息，进一步提纯蛋白。白细胞介素18(IL-18)和白介素18结合蛋白(IL-18BP)的研究对肿瘤疾病、自身免疫性疾病感染性疾病、移植物抗宿主病、代谢综合征、过敏性疾病的治疗和它们的发病机理都有很大的帮助。纯化出来的蛋白无论去做免疫活性的测定、单克隆抗体的制备，上细胞实验、上动物实验，还是用于疾病的治疗以及疾病研究都具有很广阔的意义。为疾病治疗尤其是肿瘤治疗提供了新的途径。为基础兽医学和兽医免疫学提供新的科学研究依据，产生重要的影响。

目录

声明

摘要

第一章 研究动态和研究意义

1.前言

1.1白细胞介素I8

1.2IL-18的分子结构

1.3IL-18的受体

1.4IL-18的信号转导

1.5IL-18的生物学特性

1.6IL-18与疾病之间的关系

1.7白介素18结合蛋白IL-18BP

2.实验目的和意义

第二章 材料、预测与设计

1.材料和设备

1.1试剂(见表1)

1.2试剂盒

1.3实验用质粒

1.4试验用模板

1.5其他材料

1.6实验仪器(见表2)

2.实验设计

2.1实验流程

2.2IL-18

2.3IL-18BP

2.4各重组蛋白实际大小(见表6)

第三章 实验方法

1.PCR扩增

1.1处理引物和模板

1.2PCR扩增体系

1.3琼脂糖电泳实验方法

1.4回收PCR产物实验方法

2.质粒提取

2.1实验方法

3.PCR产物和质粒的酶切

3.1实验体系

3.2实验方法

4.连接

4.1连接体系(见表12)

4.2实验方法

4.3感受态细胞的制作实验方法和材料(见表13)

5.转化和克隆

5.1反应体系(见表14)

5.2转化和克隆实验方法

6.SDS-PAGE电泳

6.1SDS-PAGE电泳胶的配制

6.2染色与脱色

7.诱导表达

7.1实验方法

7.2融合蛋白诱导条件确定的实验方法

8.PCR结果的逆向验证

9.纯化

9.1实验方法

9.2纯化原理

9.3纯化条件摸索方法

10.蛋白的浓缩

10.1浓缩方法:超滤法

10.2实验方法

11.蛋白的层析和浓度计算

11.1实验方法

11.2计算蛋白浓度和质量计算公式

第四章 结果与讨论

1.PCR扩增结果(见图11)和回收结果(见图12)和讨论

2.质粒提取结果(见图13)和回收后的检测(见图14)及讨论

3.酶切结果(见图15、16)及讨论

4.诱导表达的结果(见图17-20)及讨论

5.PCR结果的逆向验证结果(见图21)

6.融合蛋白纯化最佳诱导条件摸索结果(图22-33)及讨论

7.纯化条件摸索结果及分析

8.纯化结果

9.层析结果及讨论

9.1(PET28A-)IL-18及其浓度(见图42)

9.2(PET28A-)IL-18BP及其浓度(见图44)

9.3(PGEX-6P-1)IL-18及其浓度(见图46)

9.4(PGEX-6P-1-)IL-18BP及其浓度(见图48)

第五章 结论

参考文献:

附录实验试剂配制单

致谢