食用菌栽培相关木霉的调查和分析

摘要

本文从木霉污染的食用菌菌筒和子实体中分离纯化了49株木霉菌株。采用形态学方法以及ITS/5.8S测序分析，对这些木霉进行了分类鉴定。结果表明，中国福建、浙江等省食用菌栽培相关木霉以哈茨木霉和长枝木霉为主，少量为深绿木霉和棘孢木霉；木霉的种类与采集地点、受污染食用菌的种类有一定相关，如在浙江庆元香菇菌筒中分离的木霉主要是哈茨木霉，在广州刺芹侧耳(杏孢菇)菌筒中分离的木霉主要是棘孢木霉，而从福建浦城香菇菌筒中分离的木霉主要是深绿木霉。哈茨木霉、长枝木霉、深绿木霉和棘孢木霉的ITS总长分别为：575 bp-578 bp、579 bp-583 bp、565 bp-567 bp、和560 bp-561 bp，GC含量分别为：55.6％-56.7％、57.2％-58％、55.6％-56.1％和55.8％-55.9％，充分体现了木霉属ITS的长度多态性；ITS1序列总长分别为：221bp-233bp、248 bp-255 bp、214 bp-216 bp和213 bp-214 bp，GC含量分别为：55.4％-57.4％、57.5％-58.7％、55.4％-55.6％和55.6％-55.9％；ITS2序列总长分别为：185bp-188 bp、168 bp-183bp、189 bp-192 bp和188 bp，GC含量分别为：63.1％-65.6％、66.1％-67.9％、62.9％-64.7％和63.8％；所有木霉5.8S完全相同，总长为：159 bp，GC含量为：46.5％。ITS序列最适合用作分类鉴定标记，ITS1不适合用作长枝木霉的分类鉴定，ITS2则种间差异较小的木霉不能得到很好的区分。不同菌株的木霉其RAPD条带，生长最适温度、pH值、培养基含水量都有所不同，显示了食用菌栽培相关木霉具有多样性。木霉对5种食用菌栽培常用消毒剂敏感性测定，显示在同等条件下多菌灵和甲基托布津对木霉抑制效果最好，百菌清效果次之，之后是大生，甲霜灵不太适宜在食用菌栽培中当作防霉剂使用。 本文还研究了49株木霉对食用菌菌丝的侵染能力，发现不同木霉的侵染能力不同，同时还发现，对食用菌侵染能力强的木霉对植物病原真菌的侵染能力并不一定强，表现出木霉对真菌侵染的特异性。本文还探讨了木霉侵染食用菌的机理，结果显示，木霉可通过溶壁、缠绕等方式作用于食用菌菌丝细胞壁，木霉发酵液对食用菌和植物病原菌都有很好的抑制作用。木霉几丁质酶活性与侵染性没有直接关联：木霉侵染性强的菌株几丁质酶活性不一定高，产酶活性高的菌株侵染能并不一定强。几丁质酶活性、几丁质酶基因序列及氨基酸序列均与木霉的种类无关，如：同为深绿木霉的66和69，几丁质酶活性分别为：0.0204U/mL.min和0.0044U/mL.min，前者约是后者的5倍；不同种类的木霉可以有相似的几丁质酶序列。几丁质酶活性与侵染性无关，如木霉52无论在植物病原菌还是在食用菌中侵染性都很强，但其几丁质酶活性最弱。木霉几丁质酶基因序列和氨基酸序列与侵染性有一定关系，侵染性强的棘孢木霉29和深绿木霉52同为一类；侵染能力弱的棘孢木霉30和长枝木霉33同聚一类；侵染能力中的哈茨木霉45单独聚为一类，深绿木霉66侵染能力强也单独聚为一类。木霉纤维素酶活性与侵染性没有直接关联。侵染性强的菌株有木霉4、29、52和66，侵染性中的菌株有木霉19、38、63和69，侵染性弱的菌株有木霉28、30、37和70，但产纤维素酶活性强的菌株有木霉29和63，产酶活性中等的菌株有木霉19、28、30、37、38、52、66、69和70，产酶活性弱的菌株有木霉4号。纤维素酶活性、纤维素酶基因序列和氨基酸序列均与木霉的种类无关。克隆得到的5个木霉纤维素酶基因序列中，4株为哈茨木霉，一株为长枝木霉，其基因、cDNA和氨基酸序列同源性均很高，在97.3％～100％之间。木霉纤维素酶基因序列和氨基酸序列与侵染性无关。侵染性弱的哈茨木霉20与侵染性中的哈茨木霉90同源性最近，聚为一类；同一侵染能力的木霉44、47、65和90没有聚在一起。

目录

声明

第一章论文综述

1木霉属的研究概况

1.1木霉的分类地位

1.2国内外木霉属的研究概况

2食用菌生产中木霉污染概况

2.1食用菌生产主要竞争性杂菌

2.2食用菌生产木霉污染

2.3木霉污染食用菌防治现状

2.4食用菌栽培相关木霉研究存在的问题

3木霉的生物防治作用

3.1木霉菌生物防治进展

3.2木霉的抗菌谱

3.3木霉生防作用机理

4木霉资源的其它应用

4.1木霉生产纤维素酶

4.2木霉的其它应用

5.本研究的目的和意义

5.1本研究的科学意义

5.2国内外的研究现状与存在问题

5.3本项学术思想

5.4以期达到的目标

第二章食用菌栽培相关木霉的鉴定

1材料与方法

1.1菌株来源

1.2形态鉴定

1.3培养基和试剂

1.4木霉总DNA的提取

1.5 PCR扩增

1.6序列测定

1.7序列分析

2结果与分析

2.1形态学分类鉴定结果

2.2 ITS/5.8S测序分析分类鉴定结果

3.讨论

第三章食用菌栽培相关木霉种的内转录间隔区序列的研究

1材料与方法

1.1菌株来源(同表2-1)

1.2木霉总DNA的提取(同第二章1.4)

1.3 PCR扩增(同第二章1.5)

1.4序列测定(同第二章1.6)

1.5序列分析(同第二章1.7)

2结果与分析

2.1 ITS测序分析及分类鉴定结果

2.2 ITS1、5.8S和ITS2序列分析

3.讨论

第四章食用菌栽培中相关木霉的多样性分析

1试验材料与方法

1.1材料

1.2木霉的RAPD多样性分析

1.3木霉生物学特性多样性分析

1.4木霉对5种农药敏感性的测定

2结果与分析

2.1木霉的RAPD多样性分析

2.2木霉生物学特性研究

2.2木霉对5种农药敏感性测定

3小结与讨论

第五章木霉对食用菌侵染能力的分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.实验结果与分析

2.1木霉的侵染能力

2.2木霉的侵染机制分析

3讨论

第6章食用菌栽培相关木霉的几丁质酶活性测定与基因克隆

1.试验材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1木霉几丁质酶活性的测定

2.2木霉几丁质酶基因克隆

2.3木霉几丁质酶结构预测

3.小结与讨论

第7章食用菌栽培相关木霉的纤维素酶活性测定与基因克隆

1.试验材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1木霉纤维素酶活性的测定

2.2木霉纤维素酶基因克隆

2.3木霉纤维素酶结构预测

3.小结与讨论

总结与讨论

参考文献

致谢