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1前言
1.1水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus ,RSV)的研究概况
1.1.1水稻条纹叶枯病的发生及危害
1.1.2水稻条纹叶枯病的病害症状
1.1.3水稻条纹叶枯病的品种抗性
1.1.4水稻条纹叶枯病的流行原因分析
1.1.5水稻条纹叶枯病的预测预报及防治对策
1.1.6RSV的寄主范围和传播介体
1.1.7RSV的病原性质
1.1.8RSV的血清学
1.1.9RSV的分类地位
1.1.10RSV的基因组结构与功能工巧匠有
1.1.11RSV的致病性分化和分子变异
1.1.12RSV与寄主及介体的互作情况
1.2酵母双杂交系统及其在植物病毒研究中的应用
1.2.1酵母双杂交系统
1.2.2酵母双杂交系统在植物病毒学上的应用
1.3免疫共沉淀技术用于验证蛋白互作
1.4荧光定量PCR用于检测基因表达情况
1.5本研究的目的和意义及主要技术路线
2RSV CP、SP和NSvc4酵母表达载体的构建
2.1材料与方法
2.1.1材料
2.1.2方法
2.2结果与分析
2.2.1RSV CP、SP、NSvc4基因的PCR扩增
2.2.2重组克隆载体的鉴定
2.2.3重组酵母表达载体的鉴定
2.2.4阳性克隆的测序鉴定
2.3小结与讨论
3水稻幼苗叶征cDNA文库的构建
3.1材料与方法
3.1.1材料
3.1.2方法
3.2结果与分析
3.2.1样品总RNA的提取检测
3.2.2mRNA的分离纯化及检测
3.2.3cDNA的合成及酶切处理
3.2.4NpGADT7载体的酶切处理和检测
3.2.5NpGADT7载体的自连率检测
3.2.6cDNA载体NpGADT7的预连接
3.2.7文库库容量和滴度的测定
3.2.8文库质粒的抽提及检测
3.2.9cDNA插入片段大小的检测
3.2.10cDNA插入片段序列测定
3.3小结与讨论
4利用酵母双杂交系统研究RSV三个功能蛋白自身各两两之间的互作
4.1材料与方法
4.1.1材料
4.1.2方法
4.2结果与分析
4.2.1载体与菌株的验证
4.2.2重组质粒对细胞毒性和自激活活性检测
4.2.3蛋白自身互作的检测
4.2.4蛋白两两互作的检测
4.3小结与讨论
5利用酵母双杂交系统筛选水稻cDNA文库
5.1材料与方法
5.1.1材料
5.1.2方法
5.2结果与分析
5.2.1阳性克隆的筛选
5.2.2PCR鉴定cDNA插入片段
5.2.3阳性克隆的测序及分析
5.2.4阳性克隆与基因芯片和双向电泳结果的比对分析
5.3小结与讨论
6互作蛋白全长基因的扩增及蛋白互作的酵母双杂交验证
6.1材料与方法
6.1.1材料
6.1.2方法
6.2结果与析析
6.2.1CW8、NB2、NB5基因的PCR扩增
6.2.2CW8、NB2、NB5基因的克勤克隆
6.2.3目的基因酵毒表达载体的构建
6.2.4两蛋白互作的检测
6.2.5重组质粒的测序鉴定及互作蛋白的序列比对分析
6.3小结与讨论
7利用免疫共沉淀技术验证两蛋白之间的互作
7.1材料与方法
7.1.1材料
7.1.2方法
7.2结果与分析
7.2.1目的基因的扩增
7.2.2目的基因的克隆
7.2.3植物瞬时表达载体的构建
7.2.4含有重组质粒的农杆菌EHA105的鉴定
7.2.5外源蛋白在本氏烟中的表达情况检测
7.2.6蛋白互作情况的检测
7.3小结与讨论
8利用荧光定量PCR技术检测几个互作蛋白mRNA的表达情况
8.1材料与方法
8.1.1材料
8.1.2方法
8.2结果与分析
8.2.1样品总RNA的质量检测
8.2.2最佳退火温度的确定
8.2.3目的基因和内参基因的融解曲线
8.2.4目的基因和内参基因的扩增曲线
8.2.5目的基因和内参基因的标准曲线
8.2.6目的基因和内参基因原始定量
8.2.7目的基因的相对定量
8.3小结与讨论
9RSV CP与叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达
9.1材料与方法
9.1.1材料
9.1.2试验方法
9.2结果与分析
9.2.1PCR扩增Rubisco SSU和RSV CP基因
9.2.2pMD-R和pMD-CP克隆载体的构建
9.2.3PR和PR-S的扩增和克隆
9.2.4pGEX-PR和pGEX-PR-S表达载体的构建
9.2.5带有不同酶切位点的CP基因的扩增和克隆
9.2.6PR-CP和PR-S-CP融合基因的构建
9.2.7重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)的鉴定
9.2.8融合基因在大肠杆菌中的表达
9.2.9表达产物的Western blot鉴定
9.3小结与讨论
10全文总结与展望
10.1RSV CP、SP和NSvc4互作情况的检测
10.2与RSV CP、SP和NSvc4互作的寄主蛋白的筛选和验证
10.3mPNA在健康水稻叶片和RSV侵染后的水稻叶片表达差异分析
10.4RSV CP与水稻叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其核表达
参考文献
附录
致谢