入侵植物加拿大一枝黄花对根际土壤微生物群落多样性的影响研究

摘要

加拿大一枝黄花是1935年引进于我国上海的花卉观赏植物，后来成为大量蔓延并且在我国南部地区肆虐扩张的外来入侵植物之一。因为其强大的入侵能力，在入侵过程中逐渐形成了单生优势种群，使得其周围邻近植物、特别是同属的土著植物一枝黄花无法生长，明显降低了群落的多样性，严重威胁着生态系统的平衡，甚至给我国带来了一定的经济损失，成为迫切需要解决的生态学问题。 以往对加拿大一枝黄花的研究主要集中于形态学描述、危害性、生物学特性、检疫和除害处理等方面，而对于其土壤微生态学方面的研究较少。据此，本研究以入侵我国福建省的加拿大一枝黄花及土著植物一枝黄花为研究对象，采用传统培养方法即涂抹平板稀释法以及非培养方法即T-RFLP和DGGE两种分子生物学技术结合对它们的根际土壤微生物区系变化状况、着重对根际土壤细菌群落结构多样性进行了深入全面的分析，从土壤微生态学角度初步探讨了加拿大一枝黄花的入侵机理。结果表明： (1)加拿大一枝黄花根际土壤微生物种群发生较明显变化。 通过传统培养方法即涂平板计数法对三种土壤样品中细菌、放线菌及真菌的数量变化进行分析，可知：在三种土壤中细菌数量占据比例最大，与空白对照相比较，加拿大一枝黄花根际放线菌数量有所增加，说明加拿大一枝黄花对土壤中放线菌有一定的促进作用，而土著种一枝黄花则没有这样的变化趋势。两种黄花与空白对照相比，细菌和真菌数量都有所增加。土壤微生物数量的这种变化，可以敏感的反映土壤环境质量的变化和土壤中的生物活性。 (2)加拿大一枝黄花根际细菌群落多样性减少，说明种群失衡可能与根系分泌物中的化感物质有关。 T-RFLP分析结果表明加拿大一枝黄花根际土壤细菌群落多样性发生了明显变化。种植入侵种加拿大一枝黄花后，其根际土壤中细菌群落的优势种群发生改变，其优势种群变为放线菌纲链霉菌属菌，而土著种中的优势种群并未改变。入侵种与土著种的亚优势种群均为芽孢杆菌纲菌种，但较空白对照土壤来说，入侵种加拿大一枝黄花亚优势种群的增加幅度更大，是土著种的1.67倍，占据比例与优势种群相当。加拿大一枝黄花中链霉菌属次生代谢过程产生的抗生素对其他菌种生长具有的抑制作用以及亚优势种群数量的急剧上升，导致细菌种群多样性明显下降，这也可能就是入侵植物加拿大一枝黄花在入侵地逐渐形成单生优势种群的原因之一。 DGGE分析结果表明，在入侵种加拿大一枝黄花中引起细菌种群多样性下降，发生数量变化的大多为不可培养(Uncultured)细菌。在序列比对结果中，与可培养细菌α-变形菌纲拜叶林克氏菌科菌Chelatococcus sp.和生丝微菌属菌Hyphomicrobium sp.序列同源性均达到95％，两种群数量最多，为优势种群，而与空白对照相比，α-变形菌纲中的不可培养细菌数量减少。生丝微菌属菌Hyphomicrobium sp.是反硝化细菌，可脱氮除磷并以甲醇作为碳源，而拜叶林克氏菌科菌Chelatococcus sp.是降解多环芳烃的高效菌株。这一结果说明该菌种的出现并成为优势种群，可能同加拿大一枝黄花根系分泌物中的化感物质有着密切关系。多样性水平的下降可能是这些根系分泌物在土壤中累积所引发的。 (3) T-RFLP与DGGE两种分子生态学技术的互补性。 T-RFLP分析中，加拿大一枝黄花根际土壤的优势种群是放线菌纲菌种，而DGGE分析中也检测到放线菌纲菌种(条带41所代表的菌种)较其他两种土壤样品数量明显增加。并且，两种分子生态学手段均检测到空白对照土壤和土著种土壤中优势种群都为α-变形菌纲菌种。这些结果的一致性说明了这两种分子生态学技术在研究根际土壤微生物群落结构变化中的准确性。 另外，DGGE分析中检测到很多与α-变形菌纲中的生丝微菌属菌种序列同源性较高的细菌，而在T-RFLP中并未检测到该属菌种；T-RFLP分析中检测到每种土壤样品细菌种群数量相对于DGGE分析检测到的菌种数量要多得多。这些结论也说明了两种分子生态学手段的互补性。 综合本实验的各项研究结果，可以看出入侵种加拿大一枝黄花在入侵某环境以后，其根际土壤微生物发生了明显变化。通过传统培养方法对三种土壤微生物进行研究，可知：三种土壤中细菌数量均占据最大比例，而加拿大一枝黄花根际放线菌数量的增加，说明了加拿大一枝黄花对土壤中放线菌有一定的促进作用，这一现象在土著种一枝黄花中则不存在。通过两种非培养方法即T-RFLP和DGGE技术对三种土壤根际微生物的分析结果表明：加拿大一枝黄花根际土壤细菌群落多样性明显减少。加拿大一枝黄花根际土壤中细菌群落的优势种群发生改变，而土著种中的优势种群并未改变。入侵种与土著种的亚优势种群均为芽孢杆菌纲菌种，入侵种加拿大一枝黄花亚优势种群占据比例与优势种群相当。加拿大一枝黄花中链霉菌属的大量出现以及亚优势种群数量的急剧上升，导致细菌种群多样性明显下降，这可能就是入侵植物加拿大一枝黄花在入侵地逐渐形成单生优势种群的原因之一。在这些发生数量变化的细菌种群中，大多数为不可培养细菌。加拿大一枝黄花优势种群α-变形菌纲拜叶林克氏菌科菌Chelatococcus sp.和生丝微菌属菌Hyphomicrobium sp.的存在，可能同加拿大一枝黄花根系分泌物中的化感物质有着密切关系。多样性水平的下降可能是这些根系分泌物在土壤中累积所引发的。两种不可培养技术的结合，使得实验结果得到了一致性，在一定程度上提高了对根际土壤微生物多样性研究的准确性，为今后更深入对土壤微生物的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.前言

1.1加拿大一枝黄花研究现状与目的意义

1.1.1加拿大一枝黄花研究现状

1.1.2本研究的目的及意义

1.2根际土壤微生物研究概况

1.2.1根际土壤微生物的特点

1.2.2根际土壤微生物与植物的关系

1.2.3根际土壤微生物的影响因素

1.2.4根际土壤微生物的分子生物学研究方法

1.2.5末端限制性片段长度多态性技术

1.2.6变性梯度凝胶电泳技术

1.3本研究的主要内容、特色及创新

1.3.1主要研究内容

1.3.2特色与创新

2.材料与方法

2.1试验材料

2.2试验方法

2.2.1根际土壤三大微生物群落的测定

2.2.2根际土壤微生物多样性的T-RFLP测定

2.2.3根际土壤微生物多样性的DGGE分析

3.结果与分析

3.1加拿大一枝黄花与一枝黄花根际土壤微生物三大类群的组成及变化

3.2根际土壤微生物基因组总DNA的提取与纯化检测

3.3细菌16S rDNA的PCR扩增结果检测

3.4 T-RFLP的分析

3.4.1根际土壤细菌的T-RFLP图谱分析

3.5 DGGE的分析

3.5.1根际土壤微生物基因组总DNA的检测

3.5.2细菌16S rDNA的PCR扩增及纯化结果

3.5.3变性梯度凝胶电泳(DGGE)结果

3.5.4 BLAST序列比对及分析

4.结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

5展望

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

致谢