果蔗乙烯生物合成关键酶基因的克隆及表达分析

摘要

乙烯(Ethylene)是一种植物激素，在植物的整个生命周期中起着至关重要的作用。它对植物的种子萌发、叶片和花器官的衰老、果实成熟、性别分化等都有着重要影响，同时能对逆境胁迫如机械损伤、冷害、渍水、病原菌入侵等做出应答反应，从而提高植物的抗逆性，同时也参于植物细胞的程序性死亡。植物体内乙烯的生物合成是在ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)的催化下进行的，这两个酶的活性直接决定着乙烯的产量，利用基因工程技术，克隆出乙烯合成过程中的两个关键酶基因，通过反馈调节、反义表达等技术调控乙烯的生物合成，从而达到调控植物生长发育、成熟衰老、抗逆等生理等过程是近来人们研究的热点。本研究以果蔗为实验材料，利用同源克隆技术克隆了ACO基因，并对该基因做了相关研究。 1、设计了ACO基因的特异引物，分别从DNA和RNA两个方面克隆出ACO基因序列，测序结果表明：该基因的DNA序列为1156bp，相应的cDNA序列为1001bp，该基因含有一个155bp的内含子。将该基因在GeneBank上利用blast软件进行同源性检索发现与甘蔗的同源性达到98％(AY521566.1)与水稻的同源性达到89％ 2、利用Southern杂交方法分析该基因在13个果蔗材料基因组中的拷贝数，发现该基因在拔地拉、歪干担、丰城紫皮、白鳝、巴新、肚度、福安、宁德材料中有两个拷贝，而在其他的几个材料中都只发现有一个拷贝。 3、利用乙烯利诱导该基因的表达研究中发现：在乙烯利处理后的6h内，该基因的表达受到抑制，表达量明显降低，当到达9h时该基因又恢复正常的表达水平，12h后超出正常表达水平，有明显上调表达的现象。之后表达量又开始下降，等到72h之后，又保持了原有的表达水平。外源乙烯诱导该基因表达量的变化趋势是一个横着的“S”型。 4、本实验构建了ACO基因的植物真核表达载体和原核表达载体，并将原核表达载体转化到大肠杆菌中，利用IPTG成功诱导了该基因的表达，通过SDS-PAGE分析发现，在大肠杆菌中分离出约40KDa蛋白质。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1植物生长物质及其化学调控作用

1.2乙烯的生理作用

1.2.1乙烯在植物生长发育中的作用

1.2.2乙烯在植物抗逆反应中的作用

1.3乙烯的生物合成途径研究进展

1.3.1乙烯的生物合成途径

1.3.2乙烯生物合成影响因素

1.3.3乙烯生物合成途径的分子生物学研究进展

1.4本研究的内容与意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2供试菌种和质粒

2.1.3引物设计

2.1.4主要分子生物学及生化试剂

2.1.5主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1果蔗总RNA的提取

2.2.2果蔗基因组DNA的提取及纯化

2.2.3果蔗ACC氧化酶基因的PCR扩增

2.2.4果蔗ACC氧化酶基因PCR产物目的片段的回收

2.2.5果蔗ACC氧化酶PCR产物目的片段的克隆

2.2.6果蔗ACC氧化酶基因的PCR产物序列测定与比对分析

2.2.7果蔗ACC氧化酶基因的southern杂交分析

2.2.8半定量RT-PCR法检测果蔗ACC氧化酶基因的转录表达

2.2.9植物原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达蛋白表达

2.2.10植物真核表达载体的构建

3结果与分析

3.1果蔗基因组DNA与总RNA的提取

3.2果蔗ACC氧化酶基因在13个果蔗材料中的PCR扩增

3.3果蔗ACC氧化酶基因的DNA测序

3.4果蔗ACC氧化酶基因的核苷酸序列分析

3.5果蔗ACC氧化酶基因的氨基酸序列分析

3.6果蔗ACC氧化酶基因的蛋白质结构分析

3.6.1果蔗ACC氧化酶基因编码蛋白的疏水性分析

3.6.2果蔗ACC氧化酶基因编码蛋白的二级结构分析

3.7果蔗ACC氧化酶基因系统进化分析

3.8果蔗基因组中ACC氧化酶基因的拷贝数分析

3.9果蔗ACC氧化酶基因的转录表达检测

3.9.1果蔗ACC氧化酶基因在根和叶中的表达

3.9.2乙烯利诱导ACO基因的转录表达检测

3.10果蔗ACO基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

3.10.1果蔗ACO基因原核表达载体的构建

3.10.2目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

3.10.3果蔗ACO基因真核表达载体的构建

4讨论与结论

参考文献

附录

致谢