PCR检测螺类感染广州管圆线虫方法的研究

摘要

随着人们生活水平的提高、交通日益便捷及饮食习惯的改变，使得我国近几年来食源性疾病的病例增长迅猛，人兽共患的疾病种类也日益增多，广州管圆线虫病便是其中之一。自20世纪90年代以来我国先后在北京、温州、云南和福州等地发生多起广州管圆线虫病小范围的暴发流行，其中又以2006年夏秋季北京病例多达200多例为甚，引起市民的恐惧和相关方面的高度重视。 本文综合介绍了广州管圆线虫病的研究现状、中间宿主的种类及其诊断技术的研究现状。针对目前广州管圆线虫感染的中间宿主螺类的特点，本研究鉴定了来自广州、广西及上海等地的管圆线虫并建立了针对广州管圆线虫的PCR、实时荧光PCR的特异性检测方法，其具有检测时间短、灵敏度高，特异性强等特点，并对几种杀灭福寿螺的药物进行了实验室初步研究。本文为贝类鲜活产品等体内的广州管圆线虫检测及野外带疫普查提供了良好的诊断方法，对食品安全、预防和控制广州管圆线虫病暴发和流行具有重要的意义。研究结果如下： 1.虫种鉴定：本试验以通用引物XZ1、NC2为引物，分别对从广西、广州、福州及上海等地搜集的地方种管圆线虫提取的DNA作为模板，扩增ITS-2，通过对温度、引物浓度等条件进行优化，获得约250bp的片段，后经测序验证，结果与Genbank上广州管圆线虫序列相似性达99.5％，所以判断以上几个地方的管圆线虫均为广州管圆线虫。 2.本试验首次建立了常规PCR方法检测中间宿主福寿螺、非洲大蜗牛、白肉蜗牛等体内的广州管圆线虫的方法。根据Genbank上广州管圆线虫大亚基基因序列设计一对广州管圆线虫的特异性引物，优化了各种PCR反应条件，结果显示此方法具有较高的特异性且灵敏度明显高于组织匀浆法，达到快速、灵敏地检测广州管圆线虫中间宿主的效果。 3.本研究首次成功建立了TaqMan探针检测螺类感染广州管圆线虫的实时荧光PCR检测方法，选择保守区域设计TaqMan探针及其引物，标记发光基团和淬灭基团，对影响PCR反应的一系列因素进行了优化，结果建立的荧光PCR方法的灵敏度远远高于常规PCR检测方法，具有时间短、灵敏度高、特异性强等优点。 4.本试验研究了几种杀灭福寿螺的药物在实验室内的初步应用效果，通过对6％密达、6％冠达及新药12.5％氯代水杨胺不同浓度分组进行实验室研究，记录2d、3d、5d及7d福寿螺死亡数统计死亡率，以此确定三种药物的杀螺效果。结果显示6％冠达及新药12.5％氯代水杨胺在同等浓度下杀螺效果稍高于6％密达。说明新药氯代水杨胺有一定的应用前景，实验室内也有一定的限制性，有待于进一步田间试验确定。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章广州管圆线虫(病)及PCR、荧光PCR技术研究进展

1广州管圆线虫的主要特性

1.1成虫形态结构

1.2幼虫形态结构

2广州管圆线虫病的流行病学研究

2.1分布及病理变化

2.2传染源

2.3传播途径

2.4易感人群

3广州管圆线虫宿主(中间、转续及终宿主)研究进展

3.1主要中间宿主

3.2转续宿主

3.3终宿主

4广州管圆线虫生活史

5螺类感染广州管圆线虫诊断技术研究进展

6 PCR技术研究进展及其应用

6.1 PCR技术的基本原理

6.2 PCR的反应动力学

6.3 PCR扩增的反应要素

6.4 PCR技术的应用展望

7荧光定量PCR技术研究进展及其应用

7.1实时荧光定量PCR原理

7.2实时荧光定量PCR的种类

7.3定量方法

7.4 Real-time PCR方法的应用展望

8本实验研究的目的意义

第二章核糖体DNA-ITS序列用于管圆线虫种类鉴定的研究

1材料

1.1虫体：

2鉴定方法

2.1形态学鉴定

2.2分子生物学鉴定

3结果与分析

3.1 PCR扩增结果

3.2 DNA测序与序列分析

4讨论

4.1核糖体RNA基因及ITS序列

4.2注意事项

4.3目前鉴定技术的发展

4.4试验创新点

第三章PCR检测螺类感染广州管圆线虫方法的建立及初步应用

1材料与方法

1.1材料

1.2 PCR检测方法的建立

2结果与分析

2.1退火温度的筛选

2.2 PCR扩增结果

2.3序列测定结果

2.4两种方法提取DNA模板对PCR结果的影响

2.5灵敏度试验结果

2.6 PCR方法的验证与实际应用

3讨论

3.1关于PCR

3.2 DNA提取注意事项

3.3试验方法的创新点

3.4引物的选择

3.5建立的PCR检测技术展望

第四章TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类

1材料和方法

1.1材料

1.2实时荧光PCR方法的建立

2结果与分析

2.1 Mg2+浓度的优化结果

2.2引物浓度的优化结果

2.3探针浓度的优化结果

2.4特异性结果

2.5灵敏度验证结果

2.6所建立方法的验证

3讨论

3.1实时荧光PCR原理及应用

3.2荧光定量PCR优点

3.3引物及探针设计

3.4注意事项

3.5试验创新点

第五章几种药物杀灭福寿螺的初步试验

1材料与方法

1.1材料

1.2试验内容

2试验结果

3讨论

3.1福寿螺概述及其危害

3.2基本防治技术

3.3试验创新点

第六章小结

附录 本论文所用的试剂和试剂盒

参考文献

致 谢