琯溪蜜柚细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome)文库的构建及其应用

摘要

琯溪蜜柚(Citrus grandis cv.Guanximiyou)是我国柚类优良品种之一,原产于福建省平和县,已有四百多年的栽培历史,具有很高的经济价值。在生产上,其果实的裂瓣与汁胞粒化造成了食用品质下降,直接影响果农的经济收入。目前,对具有重要经济价值的物种的基因组学研究已成为热点,这些研究成果为解决生产上的问题提供了理论依据,但对琯溪蜜柚基因组的研究尚属空白。因此,本研究首次构建了琯溪蜜柚BAC文库,并将文库应用于汁胞粒化相关基因的筛选和BAC末端测序;用生物信息学方法分析相关的基因组序列,初步研究了琯溪蜜柚基因组结构;为进一步开展琯溪蜜柚基因组学研究,揭示柑果汁胞粒化分子机制奠定了良好基础。取得的主要研究结果如下：
　　 ⑴以琯溪蜜柚叶片为材料,比较了两种提取方法对高分子量核DNA(HMW-DNA)制备效果的影响。结果表明,改良Zhang法与Peterson法相比,前者更适合于琯溪蜜柚HMW-DNA的提取。改良Zhang法用温和的物理方法破碎细胞壁,在一定的渗透压下保证细胞核的完整性,运用miracloth和低速离心去除大部分的多糖和细胞壁碎片,经显微观察,所提取的细胞核完整、纯净、质量高;将这些细胞核用低熔点琼脂糖包埋,以琼脂糖小块的方式保存细胞核,以保持核的稳定;琼脂糖小块的最适消化时间为48 h,脉冲场凝胶电泳分析结果表明所获得的HMW-DNA大于1Mb,这些核DNA能够被限制性内切酶消化,适合于琯溪蜜柚BAC基因组文库的构建。
　　 ⑵改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法,用一次电泳回收法获得酶切后的DNA片段,构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1％,叶绿体DNA的污染率不超过1％,插入片段平均大小约120 kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。
　　 ⑶利用PCR法和Southern杂交法相结合,以琯溪蜜柚汁胞粒化相关EST M4为探针,从琯溪蜜柚BAC文库中筛选得到一个阳性BAC克隆。说明本研究所构建的BAC文库覆盖琯溪蜜柚基因组,从中能筛选得到目的片段。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列M4设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122 bp和172 bp的内含子。在M4序列的两端设计一对反向PCR引物,利用反向PCR技术,以自连接产物为模板,分别扩增得到约4000 bp和400 bp的DNA片段。将目的片段回收、克隆、测序,序列用Phred软件拼接,得到3984 bp的DNA序列,其中位于M4上游的序列3107 bp,位于下游的序列877 bp。分别用GENSCAN和FGENESH软件预测这部分DNA序列中可能包含的基因,两个软件预测的编码区基本一致。两个软件的预测编码区与NCBI上的核酸数据库进行BL,AST,BL,AST结果表明,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85％和71％的同源性:与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76％和73％的同源性。推测多铜氧化酶和果胶酯酶可能与琯溪蜜柚汁胞粒化相关。
　　 ⑷从琯溪蜜柚BAC文库中共随机挑选了120个克隆,获得105664 bpBAC末端序列。根据末端序列信息,通过生物信息学分析,对琯溪蜜柚基因组进行初步的研究。结果表明,琯溪蜜柚基因组中SSRs占总基因组的0.2％,17.8％的琯溪蜜柚BAC末端序列含有转座元件,基因组中的转座元件以反转录转座子为主。琯溪蜜柚基因组GC含量约为39.17％,估算出琯溪蜜柚的编码区大约为64.02 Mb,预测其基因数大约为32001个,编码区的GC含量约为46.7％。