福建尤溪金柑RAPD分析及柑桔类种质资源的离体保存研究

摘要

柑桔属于芸香科(Rutaceae)柑桔亚科（Acrantioideae）柑桔族（Citreae）柑桔亚族(Citrinae)植物，是具有重要经济价值的热带水果。我国是世界柑桔起源中心之一，且有4000年的栽培历史。经过数千年的进化发展，形成了种类繁多、形态复杂而又丰富的柑桔种质资源。福建柑桔种质资源非常丰富，其中国家地理标识产品尤溪金柑，已有370多年的栽培历史，长期以来一直实生繁殖，变异大，资源丰富。鉴于此，本试验首先采用RAPD分子标记对尤溪金柑进行遗传多样性分析，进一步对尤溪金柑资源及福建的主要柑桔种质资源进行离体保存研究，并克隆了早熟金柑试管苗的Mn-SOD基因，为研究柑桔试管苗保存过程中SOD的作用机制奠定基础。主要研究结果如下：
　　 1．福建尤溪金柑遗传多样性的RAPD分析
　　 本试验采集了122份尤溪金柑的叶片，这122份金柑中包括本实验室与尤溪县良种繁育场合作研究筛选出的20个优株单株及其周围对照株5株（编号为1-120号）；另外还有两个母株优株编号分别为121和122号。对这122份金柑资源进行RAPD遗传多样性分析。结果显示，供试材料两两间的相似系数较高，平均高达0.947。这说明供试的122份金柑资源亲缘关系较近。
　　 所有材料在Ⅰ(Di=13.5)处可以明显的划分为2组，第一组含有102个单株，第二组含有20个单株。第二组在Ⅱ(D2=i0.s)处又可分为两个亚组，第一亚组包括19个单株(在Ⅲ(D3=8.5)处可分为两小组，第一小组包括3个单株，第二小组包括16个单株）；第二亚组只分出一个母株。第一组在Ⅳ(D4=4.5)处又可以分为四个小组，第一小组有94个单株，第二和三小组各有两个单株，第四小组包含6个单株。
　　 在Di=13.5处划分的第2组中的20个单株均为早熟株系，可知本试验中所选引物可以清楚的区分出金柑的早熟和非早熟性状。在D2=10.5处又可把早熟金柑划分为滑皮和非滑皮两种。
　　 总体来看，周围的五株与其母株对比均有大小不等的变异。与周围五株基本无差异的母株编号为97号、91号、1号、49号。与周围五株有微小差异的母株编号为55号、61号、67号、85号、37号、43号、31号和7号。与周围五株有差异较大的母株编号为103号、19号、13号、25号、109号、115号和79号。差异最大的为73号和周围五株。
　　 尤溪金柑的遗传多样性是其种质资源多样性的基础，这点充分说明了尤溪金柑的育种潜力巨大。
　　 2．柑桔类种质资源试管苗的离体保存研究
　　 以柑桔珠心胚为主试材料，接种在未添加任何激素的MS培养基上，光照强度1000Lx,温度25士1℃，光照时间12h/d。详细观察了16种不同材料的生长情况，观察了28份柑桔离体保存试管苗的保存情况。
　　 16种试管苗材料在18个月的保存过程中，对于叶片，芦柑从1个月到18个月的叶片数目始终最多；胡柚的叶片数目最少，但是由于苏柑在保存10个月后，叶片有脱落的现象，使得苏柑在保存到第12个月时及之后成为叶片数目最少的一种。总体来看，芦柑、桔类、瓯柑的叶片比较多，金柑类和胡柚的叶片较少。对于主根长，沙糖桔在保存过程中，主根始终最长，芦柑的主根长仅次于沙糖桔；其余各材料在不同阶段根的生长速度有所波动；早熟金柑2号在保存2个月到18个月的时间里主根长度始终最短。总体看，金柑类的主根长度相比其他材料的短。
　　 从18个月存活率分析，试管苗的叶片数目与主根长度似乎与存活率没有因果关系。保存最好的为早熟金柑1号、早熟金柑2号和胡柚，18个月的存活率分别为58.3％、61.6％、57.6％,其中苏柑的存活率最差，在15个月时存活率仅为11.9％,18个月时仅为9.8％，看来MS培养基不适合苏柑的保存。
　　 很多柑桔品种都能在MS培养基中、不转接不继代的条件下保存很长的时间。如保存至今的广东阳春桔、福州血橙、福桔、重庆红桔这4种材料的保存时间长达51个月，其次为四季桔50个月，福寿桔49个月，而且这些柑桔试管苗仍有继续保存下去的可能。
　　 3．早熟金柑试管苗Mn-SOD基因克隆
　　 以常温离体保存的早熟金柑试管苗幼嫩叶片为材料，获得早熟金柑试管苗Mn-SOD基因cDNA全长序列(全长共1097bp)，并且在GenBank上登录，登录号为：GU233744.1。
　　 该Mn-SOD cDNA中5UTR为66bp,3UTR为347bp,3＇端还含有13个poly(A)尾。与不同物种间Mn-SOD基因同源性比较，同源性都比较高。其开放阅读框(ORF)共有684个碱基组成，编码228个氨基酸，ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。
　　 蛋白理化性质预测结果显示：早熟金柑试管苗Mn-SOD蛋白的分子量是25159.7Da;理论等电点pI7.83;原子组成是：C1140H1769N303O328S6，总原子数为3546;带负电的氨基酸有20(Asp+Glu)，带正点的氨基酸有21(Arg+Lys):该蛋白质由20种氨基酸组成，其中Leu、Ala、Gly、Lys、Val、Ser含量较为丰富，分别为24(11.4％)、20(8.8％)，20(8.8％)，17(7.5％)，17(7.5％)、14(6.1％),Cys含量最少，只有1(0.4％)。
　　 二级结构预测表明早熟金柑试管苗Mn-SOD蛋白由51.32％的α螺旋、14.04％的延伸链和30.07％的不规则卷曲组成。纵观蛋白的整体结构，α螺旋和不规则卷曲是早熟金柑试管苗Mn-SOD蛋白最大量的结构元件，散布于整个蛋白质中。三级结构预测表明早熟金柑试管苗Mn-SOD蛋白有3个β折叠，6个α螺旋，并且这3个β折叠被6个α螺旋所包围。这些研究结果为研究柑桔试管苗保存过程中SOD的作用奠定了重要基础。