热应激对大鼠肝脏HSP70表达及其mRNA丰度变化规律的研究

摘要

以大鼠为试验动物,采用比色法、Western-blotting、半定量RT-PCR和Real-time PCR技术,从不同热应激强度(25℃、30℃、35℃和40℃)和40℃热应激后不同处理时间(0.5h,1.5h,2h,2.5h,4h和6h)两个角度,检测分析了大鼠血清中的丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和总抗氧化能力(T-AOC)的大小,动态考察了大鼠肝脏中HSP70的表达量及其mRNA丰度变化规律,探讨HSP70mRNA水平的变化与热休克蛋白70表达的相关性,结果表明:
　　 1.应用比色法,对热应激大鼠血清中抗氧化能力指标进行了测定。与对照组25℃相比,30℃时,大鼠血清的MDA略有下降(P＞0.05)。35℃时和40℃时,血清的MDA极显著的降低(P＜0.01)。大鼠血清的SOD活力和T-AOC分别呈升高和降低的趋势,各热应激组的SOD活力和T-AOC值与对照组相比,差异极显著(P＜0.01)。在不同热应激时间处理下,大鼠血清的MDA先升高,在4h时达到高峰(P＜0.01),之后开始下降,在6h时与0.5h相比差异不显著。大鼠血清的SOD活力和T-AOC值均处于上下波动状态,各热应激处理组的SOD活力均比0.5h极显著的升高(P＜0.01)。血清的T-AOC值除在热应激处理1h后显著的升高(P＜0.05)和1.5h、2h后极显著的下降外(P＜0.01),其他各组无明显差异。
　　 2.应用Western-blotting方法,对热应激大鼠肝脏中HSP70的表达量进行了测定。大鼠肝脏HSP70在25℃就有较低水平的表达,与对照组相比,在30℃时,肝脏HSP70表达量就明显的增加(P＜0.05)。35℃和40℃2时,表达量极显著的增加(P＜0.01)。不同的热应激时间时,大鼠肝脏HSP70表达量呈先增加,到2h时表达量达到峰值(P＜0.01),随着热应激时间的延长,HSP70表达量开始下降。在热应激处理4h和6h时,HSP70表达量与0.5h相比差异不显著(P＞0.05)。
　　 3.应用半定量RT-PCR技术对热应激大鼠肝脏HSP70mRNA进行了定量研究。不同强度的热应激对大鼠肝脏HSP70mRNA的表达量有显著影响,在30℃时,HSP70mRNA表达量略有下降(P＞0.05)。在35℃和40℃时,表达量显著的高于对照组(P＜0.05)。在不同的热应激时间里,大鼠肝脏HSP70mRNA的表达量呈先迅速增加,到热应激1h时达到最高(P＜0.01)。随着热应激时间的延长,HSP70mRNA的表达量开始下降,各热应激处理组的表达量均极显著的高于0.5h组(P＜0.01)。
　　 4.应用Real-time PCR技术对热应激大鼠肝脏HSP70mRNA进行了定量研究。不同强度的热应激对大鼠肝脏HSP70mRNA的转录量有极显著的影响,各热应激处理组的HSP70mRNA的转录量极显著高于对照组(P＜0.01)。在不同的热应激时间里,大鼠肝脏HSP70mRNA的转录量呈先迅速升高,到热应激1h时达到峰值(P＜0.01),之后开始降低。在热应激1.5h时和2h时,极显著高于0.5h(P＜0.01)。而在热应激2.5h和4h时,极显著的低于0.5h(P＜0.01)。在热应激6h时,与0.5h相比差异不显著(P＞0.05)。
　　 5.通过两个等级(秩)变量间的相关分析表明,Real-time PCR和半定量RT-PCR基因检测结果极相关,两种定量PCR检测HSP70mRNA无差异,基本反映了热应激状态下HSP70mRNA转录的规律。研究表明,肝脏HSP70mRNA对热应激反映迅速,变化幅度较大,HSP70mRNA转录量在热应激反应中的总体变化趋势与HSP70表达量近似,通过mRNA的检测可在一定程度上反映HSP70的表达情况。在不同热应激强度和时间下,HSP70mRNA的转录水平呈规律性的变化,其可作为动物热应激的生物标志之一。