抗萝卜细菌性软腐病的银杏内生细菌的初步研究

摘要

为了探明银杏内生细菌在抗病虫方面的潜能，本研究从浙江杭州、山东泰安、河南郑州、福建南平以及福建农林大学校内采集来的银杏样本中共分离得到154株内生细菌，从中筛选出了57株对萝卜软腐病菌Pectobacterium carotovorumsubsp．carotovorum、番茄细菌性溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis、番茄细菌性斑点病菌Pseudomonas syringae pv．tomato、西瓜细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp．citrulli、水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzae pv．oryzicola、杨桃细菌性斑点病菌P．syringae pv．averrhoii病菌都有抑制作用的菌株，占分离总数的37％。对萝卜软腐病菌有拮抗作用的菌株共有65株，占分离总数的42．21％，最大透明圈半径达6．75mm。
　　 本研究经筛选后获得了2株对萝卜块茎软腐病有显著防病效果的菌株hyll、zy2，接种后，块茎发病时间延迟，病斑扩展缓慢，接种7d后的防治效果分别可达77．8％和50％。菌株hyll、zy2对萝卜幼苗软腐病的防治也有一定的效果，接种内生菌的幼苗发病率低，在发病后不易倒伏，接种7d后防治效果分别为53．3％和64．3％。另外，这两株内生菌对萝卜幼苗有明显的促生作用。经过生理生化测定、16S rDNA和gyrB基因序列鉴定，菌株hyll、zy2均为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamylolipuefaciens。
　　 为了进一步确定分离菌株的内生性，本研究选用菌株hyll，构建了携带gfp基因和kan基因的菌株hyll—gfp。采用摩擦涂叶接种后，菌株hyll—gfp在银杏叶片中的数量呈现先增后减，之后趋于稳定，其种群数量在5．54×104 cfu/(g．fw)左右。采用灌根法对萝卜接种后，菌株hyll—gfp在根、茎、叶中的数量均呈现先增后降的趋势。接种40 d后从银杏和萝卜体内均能分离到大量的标记细菌，说明菌株hyll能稳定存在于银杏和萝卜体内。
　　 本研究将分离得到的154株菌株利用aiiA基因引物序列通过PCR扩增，从中获得了6株含aiiA基因的内生菌株。这6株内生菌在平板上对萝卜软腐病菌没有抑制作用，但对萝卜果实和幼苗的软腐病防治均有一定的效果。其中菌株X3、gbb5的防治效果最好，都在50％以上。而且这2株内生菌对萝卜幼苗也有显著的促生作用。经过16S rDNA序列鉴定，菌株x3为苏云金芽胞杆菌B．thuringiensis，Bt，菌株gbb5为蜡质芽孢杆菌B．cereus。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 植物内生细菌研究现状

1.1.1 植物内生细菌的定义及其发展

1.1.2 植物中内生细菌的种类及定殖研究

1.1.3 植物内生细菌的生防作用及其机制研究

1.1.4 植物内生细菌对植物的促生作用

1.2 aiiA基因的应用研究现状

1.2.1 细菌的群体感应系统及群体感应淬灭

1.2.2 aiiA基因的研究进展及生物防治作用

1.3 本研究的目的及意义

第二章 银杏内生细菌的分离与筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 银杏内生细菌分离结果

2.2.2 拮抗内生细菌的筛选结果

2.3 小结与讨论

第三章 拮抗萝卜软腐病的内生细菌的筛选

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 萝卜软腐病菌致病力的测定结果

3.2.2 拮抗菌株对萝卜块茎软腐病的防治结果

3.2.3 拮抗菌株对萝卜苗期软腐病的防治结果

3.2.4 拮抗菌株对萝卜幼苗的促生作用

3.3 小结与讨论

第四章 拮抗菌株的鉴定

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 拮抗菌株的菌体形态及生理生化测定结果

4.2.2 拮抗菌株的分子鉴定

4.3 小结与讨论

第五章 菌株hy11在银杏叶片及萝卜体内的定殖研究

5.1 材料与方法

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验方法

5.2 结果与分析

5.2.1 携带gfp和kan基因的标记菌株的获得

5.2.2 菌株hy11-gfp在银杏叶片内的定殖动态

5.2.3 菌株hy11-gfp在萝卜组织内的定殖动态

5.3 小结与讨论

第六章 含aliA基因的银杏内生细菌对萝卜软腐病的防治及促生作用

6.1 材料与方法

6.1.1 实验材料

6.1.2 实验方法

6.2 结果与分析

6.2.1 含aiiA基因的银杏内生细菌的筛选结果

6.2.2 含aiiA基因的银杏内生细菌对萝卜软腐病的拮抗作用

6.2.3 含aiiA基因的内生细菌对萝卜幼苗的促生作用

6.2.4 菌株x3、gbb5的基于16S rDNA序列的鉴定

6.3 小结与讨论

总结

参考文献

致谢