短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)对龙眼保鲜机理的研究

摘要

本研究通过分析龙眼果实采后腐烂过程相关酶系的变化规律，探讨龙眼褐变和腐烂的机理，并筛选了龙眼保鲜微生物，研究了该保鲜微生物的生物学特性和保鲜机理，制备了龙眼微生物保鲜菌剂。主要研究结果如下：
　　 1龙眼保鲜微生物的筛选及相关生物学特性分析
　　 从本实验室已有菌种库中筛选到6株对龙眼腐生真菌和细菌均具有较好拮抗作用的菌株，其中短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX(Brevibacillus breivs FJAT-0809-GLX)对龙眼腐生细菌和真菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径为15.87 mm，抑菌带为6.27 mm。对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX培养条件的研究表明，该菌株培养的最适条件为：转速180 rpm、pH值7.0的培养基、250 mL三角瓶装瓶量20-40 mL、培养48 h。对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX的全基因组测序初步分析表明，该菌株的基因组规模为6 Mb，预测得到5666个基因，平均长度为933 bp，基因密度达到87.83％，基因组的GC含量为47.30％，具有177个菌株特异基因，这些基因的功能如何还有待于进一步的分析。
　　 2龙眼果实致腐机理的分析
　　 从细胞形态上看，龙眼外果皮结构未发生明显的变化，但内果皮细胞结构变化比较明显，从2级果实开始，内果皮开始发生破裂，4级和5级果实的内果皮细胞骨架完全发生瓦解，内果皮完全腐烂，有的部位还可以看到菌丝。综合龙眼果肉和果皮的腐烂特征，将龙眼果实划分为6个腐烂等级。
　　 随着腐烂程度的加深，龙眼果实的呼吸速率加快，0级龙眼果实呼吸速率为61.17mg/kg hr，4级的龙眼果实呼吸速率达到最大为382.71 mg/kg hr。龙眼果实过氧化物酶(Peroxidase，POD)和多酚氧化酶(Polphenol oxidase，PPO)活性随腐烂程度加深也增高，腐烂程度达到5级的果皮POD酶活性最高，为15625 U/min g，腐烂程度达到4级的龙眼果皮PPO酶活性最高，为687.5 U/min g。而可溶性固形物(Total soluble solids，TSS)含量随腐烂程度加深却呈现降低的趋势。
　　 龙眼果实腐生细菌和真菌的分离和鉴定结果表明，烂果的真菌和细菌数量和种类均多于好果。腐生细菌主要包括藤黄微球菌(Micrococcus lutens)、科氏葡萄球菌(Staphylococus cohnii)、短芽胞杆菌(Brevibacillus choshinensis)和多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)；腐生真菌主要包括粉红聚端孢菌(Trichothecium roseum)和Neofusicoccum parvum。从龙眼果实腐生细菌和真菌的鉴定结果看，未分离到龙眼果实采后病原菌，说明采后病原菌的侵染不是龙眼果实腐烂的主要因素。
　　 3短短芽胞杆菌主要功能成分分析
　　 对短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX活性物质提取方法优化的结果表明，采用大孔树脂法和氯仿萃取法这2种方法提取的短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质的得率和抑菌效果有所不同，大孔树脂法提取的物质得率较高，为1.593 g/L，抑菌效果也最好，抑菌圈直径为27.33 mm。进一步对大孔树脂提取法各因素的优化表明，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质收集的最佳方案为：将短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX发酵液常温3600 rpm离心30 min，取上清液，按比例与40 g/L大孔树脂AmberliteXADl6混合，28℃，160 rpm振荡4 h后，填柱，并用水洗柱后，采用3倍洗脱体积的丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液，40℃旋转蒸发进行浓缩，所得物质即为短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质。
　　 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质溶于二甲基亚砜、超纯水，不溶于石油醚。随着处理温度的升高，短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质的抑菌圈直径逐渐减小，在100℃条件下，抑菌圈直径最小，为18.17 mm。在100℃条件下处理0 h、2 h、4 h和6 h后，其抑菌效果逐渐降低，抑菌圈直径分别为20.47 mm、16.67 mm、15.42 mm和13.39 mm。随着pH值的增大，活性物质的抑菌活性有所降低，当pH=7.0时，抑菌圈直径为20.52 mm，当pH=11.0时，抑菌圈直径为18.46 mm。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对青枯雷尔氏菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、茄形镰孢菌、苹果树腐烂病菌和苹果轮纹病菌等6种植物病原真菌都具有较强的抑制作用，对大肠杆菌K88和沙门氏菌ATCC14028这2种动物病原菌也具有一定的抑制作用，对大肠杆菌K88的抑菌效价为29.22 U/mL。
　　 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质在三氯甲烷、丙酮、乙醇和甲醇这4种不同有机溶剂中的共有功能成分包括10种，分别为邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯、双氢麦角胺、羟苯乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、绵马次酸、3-异丁基-六氢吡咯[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮、二乙基二硫代磷酸、3-苯甲基-六氢吡咯[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮、4-(乙酰苯基)苯甲烷和尼泊金丙酯。其中，羟苯乙酯和邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯的相对含量较高，对大肠杆菌K88都具有抑菌效果。羟苯乙酯的抑菌效果最好，与硫酸链霉素(5 U/mL)的抑菌效果相差不大(P<0.05)，抑菌圈直径为17.81±0.28 mm，最低抑菌浓度为1.57 mg/mL，推测羟苯乙酯是其主要的抑菌功能成分。
　　 4短短芽胞杆菌保鲜机理的分析
　　 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对龙眼果实、鲜切苹果和台湾大青枣都具有很好的保鲜效果，对龙眼果实的保鲜率为87.50％，并且可以防止腐生菌的侵染，保持果实色泽，维持可溶性固形物的含量，保持果实的风味。
　　 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX功能成分对龙眼果实腐生真菌和细菌抑菌能力有所不同。羟苯乙酯对腐生真菌和细菌的抑菌能力最大，抑菌圈直径在18.41 mm-31.06 mm之间。
　　 短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对龙眼果皮POD酶活性具有一定的抑制作用，当其浓度为150 mg/mL时，抑制率最高，为9.57％。对其功能成分的抑制作用分析表明，在其中起主要作用的为羟苯乙酯，当其为50 mg/mL时，对龙眼果皮POD酶活力抑制率为25.69％，其次为麦芽酚和苯酚。不同浓度短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对二苯代苦昧酰基自由基(DPPH·)均具有一定的清除作用，且在一定范围内短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质清除自由基的能力与其浓度呈明显的量效关系，当其浓度为100mg/mL时，对DPPH·的清除能力最强，清除率最高为61.35％。在其中起主要清除作用的功能成分为麦芽酚，当其浓度为200 mg/mL时，清除率最高为68.35％。不同浓度短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX活性物质对羟基自由基(OH)的清除率也有所不同，其中以7.5mg/mL时的清除率最高，达到98.20％，在其中起主要清除作用的成分为羟苯乙酯，当其浓度为150 mg/mL时的清除率最高，达到68.38％。
　　 5龙眼保鲜菌剂的研究
　　 将2‰琼脂和2-5％的NaCl添加到龙眼保鲜菌发酵液中制备成龙眼保鲜菌剂，其活菌含量较高，胶悬剂效果最好，质地均匀，无上下分层。
　　 龙眼保鲜菌剂对龙眼果实具有较好的保鲜效果，常温条件下(温度28-32℃，湿度50-70％)贮藏5 d，龙眼保鲜菌剂处理的腐烂率低于对照，仅为32.67±1.20％，对“早钟六号”和“解放钟”枇杷果实也具有较好的保鲜作用，保鲜率在80％-90％之间。此外，该保鲜菌剂还可以降低龙眼和枇杷果实的失重率，防止腐生菌侵染，维持可溶性固形物含量，保持果实风味。在高温高湿条件下，该保鲜菌剂还对不同鲜切水果(西瓜、皇冠梨、苹果、草莓和台湾大青枣)也具有较好的保鲜效果，防止腐生菌的滋生，保持果实色泽和口味。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1 水果保鲜方法的研究进展

1.1 物理保鲜方法的研究进展

1.2 化学保鲜方法的研究进展

1.3 生物保鲜方法的研究进展

2 水果保鲜机理的研究进展

2.1 不同保鲜技术对果实呼吸作用的抑制作用

2.2 不同保鲜技术对果实相关酶和其它物质的影响

2.3 不同保鲜技术对果实采后病原菌的抑制作用

3 龙眼保鲜技术的研究进展

3.1 化学保鲜方法对龙眼果实的保鲜效果

3.2 物理保鲜方法对龙眼果实的保鲜效果

3.3 生物保鲜方法对龙眼果实的保鲜效果

4 本研究的意义和主要研究内容

4.1 本研究的意义

4.2 本研究的主要内容

第二章 龙眼保鲜微生物的筛选及短短芽孢杆菌生物学和基因组学研究

第一节 龙眼保鲜微生物的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 短短芽胞杆菌的生物学特性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 龙眼保鲜菌短短芽胞杆菌全基因组序列分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 龙眼果实致腐机理的研究

第一节 龙眼果实采后腐烂等级的划分

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 龙眼果实采后腐烂过程的生理变化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 龙眼果实采后腐烂过程的病理变化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 短短芽胞杆菌鲜功能成分的研究

第一节 短短芽胞杆菌保鲜活性物质提取方法的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 短短芽胞杆菌保鲜活性物质的生理生化特性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 短短芽胞杆菌保鲜功能成分分离方法的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四节 短短芽胞杆菌保鲜功能成分的生理活性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 短短芽胞杆菌保鲜机理的研究

第一节 短短芽胞杆菌保鲜功能成分对不同水果的保鲜特性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 短短芽胞杆菌保鲜功能成分对龙眼腐生菌的抑制作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 短短芽胞杆菌保鲜功能成分的生理效应

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 龙眼保鲜菌剂的研究

第一节 短短芽胞杆菌发酵技术的研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 龙眼保鲜菌剂的制备工艺

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 龙眼保鲜菌剂的毒性检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四节 龙眼保鲜菌剂的田间试验

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第七章 小结

参考文献

附录 Ⅰ

附录 Ⅱ

附录 Ⅲ

个人简介

致谢