源于地衣的苏云金芽胞杆菌分离及对广州管圆线虫生测和活性因子的研究

摘要

本研究以非维管植物地衣为分离材料，采用抗生素加醋酸钠热处理的方法，从48个地衣样本中分离到6株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)，编号为BRC-ZQL1至BRC-ZQL6。
　　 为了解其生物学特性，分别对这6个菌株进行生理生化测定，结果显示：这些菌株在生理生化指标上都存在着一定差异。通过cry基因PCR--RFLP检测发现：6个菌株均含有cry1基因(cry1Ad、cry1Ba、cry1Cb、cry1Da、cry1Ea)；5个菌株含有cry2基因(cry2Ac、cry2Ah)；这些菌株还含有cry9、cry1Ⅰ等基因。BRC--ZQL5、BRC--ZQL6菌株的PCR--RFLP图谱出现特异性片段，推测其存在新基因。
　　 选用BRC--ZQL1至BRC--ZQL6和实验室保存的3个菌株(Bt8010、Bt HD1、Bt010)，以不同浓度菌液对广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)进行杀虫活性初步鉴定，发现不同菌株毒性存在较大差异，其中BRC--ZQL3杀虫效果最好。提取BRC--ZQL3伴孢晶体蛋白对A.cantonensis进行生测，处理24 h和48 h的LC50分别为2.85415和1.10599 mg/mL，表明BRC--ZQL3对A.cantonensis具有较明显的杀虫活性。
　　 以BRC-ZQL3总DNA为模板，设计引物对该菌株的cry2基因进行PCR扩增。将PCR产物与克隆载体连接，得到重组质粒，转化JM109感受态细胞，测序可知目的基因ORF为1899 bp。将该基因序列提交NCBI(GenBank登录号：FJ550343.1)，国际Bt命名与分类委员会将其命名为cry2Ah2基因，其为一个新基因。用生物信息学软件分析该基因，其蛋白由632个氨基酸组成，分子量约为70.84 kDa；对该蛋白进行了同源比对和理化性质分析，同时预测了二维结构和三维结构。
　　 构建表达载体pGEX--cry2Ah2，转化大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)，得到具有重组质粒pGEX-cry2Ah2的BL21(DE3)，SDS-PAGE结果证明cry2Ah2基因能在该重组菌中成功表达。
　　 将重组大肠杆菌IPTG诱导培养，用其菌裂解液对A.cantonensis进行毒力测定，24 h和48 h的校正死亡率分别为12.77％和22.91％，证明Cry2Ah2蛋白对A.cantonensis具有一定程度的毒性，但其杀虫活性不高，这也表明BRC-ZQL3还存在其它的杀虫活性因子。
　　 为提高BRC-ZQL3产孢水平，应用数学统计方法对该菌株发酵培养基进行优化，获得最佳培养基配方为：黄豆饼粉2％、玉米粉0.42％、酵母膏0.39％、磷酸二氢钾0.025％、七水硫酸镁0.035％、碳酸钙0.04％、初始pH值为7.2。优化后BRC-ZQL3产孢水平达到3.92×10-8 mL-1与响应面数学模型的预测值只有2.9％的误差，比初始发酵培养基产孢水平提高了60.66％。
　　 本研究在国内外率先从地衣中分离获得了Bt菌株，不但增进了对Bt菌株习居环境的了解，而且也为野生型Bt新菌株的获得拓展了采集来源。同时，首次用Bt对A.cantonensis进行毒力测定，筛选到了对A.cantonensis具有较强杀虫活性的Bt菌株，并对该菌株的毒性因子进行研究，为寻找防治A.cantonensis的新途径作了有益探索。

目录

文摘

英文文摘

第1章 前言

1 从土壤、水体、动物等处分离苏云金芽胞杆菌的研究进展

2 从植物分离苏云金芽胞杆菌的研究进展

2.1 从种子植物分离苏云金芽胞杆菌

2.2 从非维管植物分离苏云金芽胞杆菌

3 苏云金芽胞杆菌cry,基因的种类、功能及鉴定

3.1 ICPs基因种类

3.2 ICPs基因的结构与功能

3.3 ICPs的杀虫机理

3.4 ICPs基因的鉴定

4 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素的研究

5 苏云金芽胞杆菌在线虫防治中的应用概况

6 广州管圆线虫的危害及其防治

7 响应面分析法优化苏云金芽胞杆菌菌株发酵培养基

8 本研究的目的和意义

第2章 源于地衣的苏云金芽胞杆菌分离及生理生化检测

1 材料和方法

2 结果与分析

2.1 福州市地衣分布特点

2.2 菌株的分离和形态观察

2.3 菌株的生理生化检测

第3章 分离菌株cry基因PCR-RFLP鉴定

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第4章 Bt菌液及伴孢晶体蛋白对广州管圆线虫的毒力测定

1 材料和方法

2 结果与分析

2.1 伴孢晶体蛋白浓度测定

2.2 广州管圆线虫形态观察

2.3 菌液生测

2.4 BRC-ZQL3伴孢晶体蛋白毒力测定

3 讨论

第5章 cry2Ah基因的克隆与测序

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 克隆基因

2.2 测序结果

3 讨论

第6章 cry2Ah2基因的生物信息学分析

1 材料和方法

2 结果与分析

2.1 碱基序列及氨基酸序列分析

2.2 蛋白理化性质与残基组分分析

2.3 结构功能区预测

2.4 基序(Motif)搜索

2.5 蛋白质结构预测

3 讨论

第7章 cry2Ah2基因的原核表达及对广州管圆线虫的毒力测定

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 原核表达菌BL21/pGEX-cry2Ah2的构建

2.2 目的蛋白诱导表达

2.3 表达产物的毒力测定

3 讨论

第8章 响应面分析法优化BRC-ZQL3发酵培养基

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.2 Plackett-Burman设计筛选产孢重要影响因素

2.3 响应面法优化培养基组成

3 讨论

总结

参考文献

附录

致谢