海洋产毒素细菌的筛选和产毒机理的初步研究

摘要

海洋微生物毒素资源丰富，是海洋天然产物的重要组成部分，也是海洋生物活性物质研究中进展最迅速的领域。海洋微生物所产毒素具有化学结构独特、新颖多样，活性广泛且活性强，作用机理特殊等优点。因而，从广阔无垠的海洋中发掘各类海洋毒素及产毒细菌逐渐引起了人们的重视。目前，国内外以海洋生物毒素为主要成分开发成功的医药产品已经在临床上得到应用，海洋细菌毒素在生物医药基础研究和临床治疗中将一直占有一席之地，具有广阔的应用前景。然而，海洋毒素和产毒素细菌的发掘与研究才是一切应用研究的基础。
　　本研究用216L、Zobell2216E和普通海水琼脂等培养基从来自南大西洋、印度洋、太平洋和北极的海底沉积物与近海海水样品中分离出97株海洋细菌。这些海洋细菌分布于交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、深海螺旋菌属（Thalassospira）、海杆菌属（Marinobacter）葡萄球菌属（Staphylococcus）、盐单胞菌属（Halomonas）、海洋杆状菌属（Maricaulis）、埃希氏菌属（Escherichia）、假苍白杆菌属（Pseudochrobactrum）、球形芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、微杆菌属（Microbacterium）和短状杆菌属（Brachybacterium）等12个属。并通过统计种属的分布情况，分析了深海沉积物样品和近海海水样品细菌多样性的差异。
　　在分离培养获得海洋细菌后，采用血平板法测试法和MTT细胞毒性试验法进行了产海洋生物毒素菌株的筛选。从血平板中挑出能在菌落周围形成2~4 mm、界限分明的溶血圈具有溶血现象的菌株。共筛选出能产生溶血素的菌株10株。再对余下不溶血的菌株进行发酵，取发酵液过滤除菌，然后用无菌发酵液处理HEK-293细胞进行MTT细胞毒性检测。通过此方法筛选出3株具有明显细胞毒性的菌株。
　　从上述的产毒菌株中挑选出一株未见毒素研究相关报道的深海螺旋菌（Thalassospira xianhensis）SDM1-7作为研究对象。首先，通过分析不同温度下深海螺旋菌溶血现象的差异，发现随着温度上升菌株的溶血现象加强。然后，通过生物信息学分析比对发现Thalassospira xianhensis基因组中含有hlyA同源基因。与Rhodospirillum rubrum ATCC11170中hlyA基因的相似度为87%。随之通过半定量RT-PCR技术，分析溶血素Hemolysin A的hlyA基因在不同温度下的基因表达差异。最后，利用 SDS-PAGE分析发现温度因素导致菌体蛋白表达出现差异。

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第一章 文献综述

1. 海洋微生物研究意义

2. 海洋微生物多样性

3. 海洋毒素

4. 海洋毒素研究方法

第二章 近海海水和深海沉积物中细菌多样性分析

1. 实验材料及方法

2. 结果与分析

3. 讨论

4. 小结

第三章 产毒素海洋细菌的筛选

1. 实验材料及方法

2. 结果与分析

3. 讨论

4. 小结

第四章 环境因素对深海螺旋菌产毒的影响

1. 实验材料及方法

2. 结果与分析

3. 讨论

4. 小结

总结与展望

参考文献

致谢

附 录