福建马铃薯病毒病的快速检测技术

摘要

马铃薯所具有的经济价值位列世界主要作物第四位，在我国马铃薯的总产量以及种植面积均居世界首位。马铃薯病毒病是马铃薯生产中制约马铃薯高产、优产的关键性因素，通过脱毒技术生产健康种薯或近乎无毒的种薯，已经成为预防马铃薯病毒病最为成功的手段之一。因此，建立一套快速，高效，稳定的马铃薯检测技术有利于加速育种进程，保证种薯质量和调运的安全。本研究的主要目的是研究并建立适合于同时检测四种马铃薯病毒的单重、多重RT-PCR分子检测体系，并针对反应体系中的引物浓度比例、退火温度、Mg2+浓度比例等影响因素进行优化，以期为研制马铃薯病毒病检测试剂盒的开发提供技术保障。
　　1、RT-PCR特异性引物的设计：根据已发表马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯S病毒(PVS)及马铃薯M病毒(PVM)四种病毒的外壳蛋白（CP）序列设计特异性引物对，扩增片段大小为379bp（PVY）、514bp（PYA）、656bp（PVS）及881bp（PVM）。
　　2、PCR检测体系优化：实验结果显示，适当提高退火温度，有利于四重PCR扩增；Mg2+浓度对单重PCR扩增影响不大，但对四重PCR的扩增有着明显的影响；dNTPs浓度和引物浓度比对PCR扩增效果影响不大。
　　3、扩增产物的准确性验证：经NCBIBLAST比对，结果表明PVY、PVA、PVS和PVM四种病毒的PCR扩增产物的序列与NCBIBLAST报道的相应病毒的序列同源性分别达到99%、98%、98%和98%以上，表明四种病毒的RT-PCR扩增产物准确无误。
　　4、PCR灵敏度测定：通过对四种病毒cDNA的浓度稀释，对4种病毒在单重PCR检测中的最低检测浓度进行测定，结果显示，在PVY、PVA、PVS和PVM的单重PCR检测中各病毒的最低检测浓度分别为：0.299ng/?L，2.67ng/?L，0.296ng/?L和0.202ng/?L。
　　5、研究体系的应用：采用四重RT-PCR检测体系，对来自周宁、福州、龙岩及龙海地区共88个马铃薯种薯样品检测，结果表明，有7个样品为健康块茎；有17个样品检测出PVY；有12个样品检测出PVA；有3个样品检测出PVS；有17个样品检测出PVM；有6个样品检测出PAY和PVA；有2个样品检测出PVY和PVS；有2个样品检测出PVY和PVM；有21个样品检测出PVA和PVM，有1个样品检测出PVS和PVM。

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第一章 前言

1.1 马铃薯病毒病概述

1.2 我国主要马铃薯病毒种类简介

1.3 马铃薯病毒检测技术的研究进展

1.4 实验的目的及意义

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果与分析

3.1 引物特异性检测

3.2 四种病毒扩增产物的测序及同源性比较

3.3 PCR退火温度的选择

3.4 PCR反应条件优化

3.5 灵敏度检测

3.6 马铃薯多重PCR的实际应用

第四章 小结

参考文献

致谢