马尾松(Pinusmassoniana)内生真菌筛选培养及其在产油脂中的应用

摘要

植物内生真菌泛指那些在其整个生活史或生活史中的某一阶段生活在植物组织内部，对植物组织不引起明显病害症状的一类真菌。植物内生真菌在各种植物中都普遍存在，分布在根、茎、叶等器官表皮下的组织中。植物内生真菌在植物体内生存，与宿主植物在长期演化中互惠互利，共同生长。前人对内生真菌的生物学作用和内生真菌的次生代谢产物做了很多相关研究。研究表明，植物内生真菌对宿主植物的生长有促进作用，能增强宿主植物对病虫害的抵抗能力，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抗性，在植物体内能产生多种具有生物活性的次生代谢产物。同时，宿主植物与其内生真菌长期共生，相互影响，大多数植物内生真菌能够产生与其宿主相同或相似的活性成分。马尾松栽植面积广，是我国松属（Pinus）树种中重要的用材树种，也是荒山造林的先锋树种。马尾松富含松脂，是中国主要产脂树种。关于马尾松内生真菌在产油脂中的应用研究未见报道。
　　以马尾松为研究对象，进行马尾松内生真菌的分离和鉴定，并作多样性分析，运用马尾松内生真菌液体发酵液进行微生物采脂研究、进行马尾松内生真菌对松脂产量影响的回归分析、马尾松内生真菌产油脂效果研究及内生真菌分子生物学鉴定。为马尾松的综合开发利用，进一步形成生产力提供技术依据。
　　主要内容和结果如下：
　　1、马尾松各器官的样品采自福建省漳平五一国有林场。经表面消毒，从马尾松根、茎、叶中分离得到102株内生真菌。经显微形态观察，归属为11个属，分属于6科6目4纲3门。表明马尾松的内生真菌种类具有丰富的多样性。分离鉴定结果发现，内生真菌分布在马尾松的不同器官组织的菌株数量和种群上都存在较大差异，从叶器官分离到的内生真菌株数和涉及属的数量最多，茎部次之，根部最少。毛霉属（Mucor）、木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）在根、茎、叶器官中都有分布，其它属只分布在根、茎、叶中的某两个器官组织中。曲霉属（Aspergillus）、拟茎点霉属（Phomopsis）、茎点霉属（Phoma）和青霉属（Penicillium）是马尾松内生真菌中的优势属。其余属（镰刀菌属（Fusarium）、拟青霉属（Paecilomyces）、生赤壳属（Bionectria）、叶点霉属（Phyllosticta）和丛梗孢属（Monilia））菌株数相对较少，为非优势属。
　　2、首次应用马尾松内生真菌进行微生物采脂研究。从马尾松根、茎、叶分离出的内生真菌中选取十株优势菌株进行试验。研究区位于福建省龙岩市新罗区小池镇卓洋村。将10株马尾松内生真菌发酵液及其组成的混合发酵液替代化学刺激剂分别涂刷于割沟进行微生物采脂。通过试验，涂菌后的马尾松平均单株单刀产脂量均高于涂菌前平均单株单刀产脂量，而混合发酵液形成的松脂增产率最高，为40.83％。
　　从该试验的10株马尾松内生真菌中选取形成松脂增产率前3位的菌ZI41155、BS4787、FH0131进行试验，研究不同菌种、不同胸径和不同侵染次数对马尾松松脂产量的影响。采用正交试验设计方法，以菌种、胸径和侵染次数为试验因素，各因素取3个水平，进行3因素3水平正交试验。试验结果表明，菌种、胸径和侵染次数3种因素对松脂产量影响程度的大小有较大的差异。胸径对松脂产量的影响程度最大，菌种次之，侵染次数对松脂产量的影响最小。在显著水平α=0.01上，菌种对松脂增产率的影响极显著。在显著水平α=0.05上，侵染次数对松脂增产率的影响不显著。菌ZI41155形成的松脂增产率均值最高，菌BS4787的次之，菌FH0131形成的松脂增产率均值最低。三个径阶中，松脂增产率均值随胸径的增大而增大。三种侵染次数形成的松脂增产率均值随侵染次数的增多而增大。
　　3、选取第二部分正交试验得出的菌种因素中最优水平菌ZI41155进行试验。以胸径为自变量，松脂增产率为因变量，研究用菌ZI41155发酵液进行微生物采脂时，形成的松脂增产率与胸径的关系。随机选取100株胸径在18cm以上的马尾松，将菌ZI41155的发酵液涂刷于马尾松树体割沟，进行微生物采脂试验。根据最小二乘法的建模原理和方法，利用SPSS数据处理软件对胸径及松脂增产率进行回归分析，得到回归方程：Y=-28.608+2.76X。经方差分析及对回归系数的显著性检验结果均表明，所建立的回归方程显著，表明所建立的回归方程有效。
　　4、首次进行马尾松内生真菌产油脂效果的研究。从第二部分试验的10株马尾松内生真菌中选取形成松脂增产率前4位的菌ZI41155、BS4787、FH0131、BS18200进行试验。用苏丹黑染液对菌丝染色，在光学显微镜下观察，发现四株内生真菌菌丝中均有油滴存在。应用酸热法提取油脂，测定油脂含量，并采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析油脂组分。结果表明：4株马尾松内生真菌油脂含量均达20%以上，最高含量达30.56%。4菌株都含有脂肪酸，且均占油脂提取物的64%以上，不饱和脂肪酸含量均达46％以上。油脂组分主要为棕榈酸酯、硬脂酸、油酸、亚油酸、反油酸等，其中油酸含量最大，达42.08%。
　　5、对第四部分试验的4株马尾松产油脂内生真菌ZI41155、BS4787、FH0131、BS18200进行分子生物学鉴定。对4株马尾松内生菌产油脂菌株进行基因组DNA提取、PCR扩增、序列测定。将测序得到的基因序列与GenBank中核酸数据库序列进行Blast分析，利用ClustalX2.1软件对多个序列进行比对分析，应用MEGA5.0软件进行系统发育树构建分析，进行亲缘关系和系统发育分析。通过比对分析，结合其菌落形态特征，初步鉴定菌ZI41155为拟青霉属（Paecilomyces）、菌BS4787为生赤壳菌属（Bionectria），菌FH0131和BS18200为镰刀菌属（Fusarium）。

目录

声明

第一章 引言

1 植物内生真菌概述及其研究进展

2 马尾松内生真菌研究进展

3 马尾松微生物采脂研究

4 微生物油脂研究进展

5 本项研究的科学意义

6 主要研究内容和研究路线

7 本研究主要创新点

第二章 马尾松内生真菌的分离鉴定及其多样性分析

1 材料

2方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 微生物采脂研究

1 马尾松内生真菌对松脂产量的影响初步研究

2 不同菌种、不同胸径和不同侵染次数对马尾松松脂产量的影响

第四章 基于马尾松内生真菌诱导下，宿主胸径对松脂产量影响模型

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第五章 马尾松内生真菌产油脂效果的研究

1 材料

2 方法

3结果与分析

4 讨论

第六章 内生真菌分子生物学鉴定

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第七章 结论与展望

参考文献

致谢