‘平潭水仙’β-葡萄糖苷酶与挥发性芳香物质形成关系的研究

摘要

在‘平潭水仙’开花过程中，本研究利用HS-SPME-GC-MS分离分析技术，结合保留值、内标法进行了挥发性芳香物质定性定量分析；利用XAD-2树脂吸附法以及有机溶剂成功分离了游离态、键合态芳香组分，并在外源β-葡萄糖苷酶的水解作用释放了键合态芳香物质，检测到了挥发性芳香物质；同时利用丙酮粉法研究了β-葡萄糖苷酶活性变化趋势，并克隆分离了四个β-葡萄糖苷酶基因家族成员和一个芳樟醇合成酶基因家族成员，进行了荧光定量表达分析，所得主要结果如下：
　　1.1、‘平潭水仙’不同时期挥发性物质分析
　　自水培之日(0d)起至现绿色花苞(19d)，‘平潭水仙’均未释放挥发性物质，随着花苞转白到完全绽放，挥发性物质种类及含量随之不断增多，后伴随着花的衰老，挥发性物质也相应减少。‘平潭水仙’花主要的挥发性物质是萜烯类、醇类、酯类，以Z-罗勒烯、芳樟醇、乙酸苯甲酯、别罗勒烯为主，其中芳樟醇是贡献最大的特性香气组分，其次为罗勒烯，两组分均随着花的盛开，含量显著增加，进入衰老期又急剧降低。
　　1.2、‘平潭水仙’不同时期游离态、键合态芳香物质分析
　　在‘平潭水仙’花盛开过程中，19d的绿芽虽未检测到太多的游离态芳香物质，却富含较多的键合态芳香物质；随着花的盛开，游离态的芳香物质组分增多，键合态芳香物质较少；进入衰老期游离态芳香物质减少而键合态芳香物质变多。
　　1.3、‘平潭水仙’不同时期β-葡萄糖苷酶活性变化
　　随着花的盛开，酶活显著提高至27d达到最大值，伴着花的衰老酶活又逐渐降低。β-葡萄糖苷酶活性的动态变化趋势与‘平潭水仙’挥发性芳香物质的变化趋势一致，初步推测了β-葡萄糖苷酶与‘平潭水仙’挥发性芳香物质形成的关系，即随着花的盛开，初期贮存的键合态芳香物质在逐渐提高活性的β-葡萄糖苷酶的水解糖苷键作用下，不断释放出具有芳香物质的配基，增加了花的游离态芳香物质，从而增加了水仙花的香味，后伴随着花的衰老，酶活性降低，水解糖苷键的作用减弱，芳香物质多以键合态的形式存在，致衰老过程中花的挥发性芳香物质也随之减少。
　　1.4、β-葡萄糖苷酶基因家族成员、芳樟醇合成酶基因克隆和表达分析
　　本研究尝试克隆β-葡萄糖苷酶基因家族成员和芳樟醇合成酶基因，成功克隆了3个(Nt-BGLⅠ-1、Nt-BGLⅠ-2、Nt-BGLⅠ-3)属于糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因家族成员和1个(Nt-BGLⅢ-1)属于糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因家族成员，核酸序列长度在1665~2155bp，编码区为1464~1878bp，编码487~652个氨基酸，5’UTR序列长度均比3’UTR短；克隆分离出一条芳樟醇合成酶基因(Nt-Lis I)，全长为1668bp，开放阅读框(ORF)大小为1575bp，编码524个氨基酸，有一个DDXXD基序，无RRx8W基序，可能属于TPSg家族成员。根据实时荧光定量分析结果推测主要由Nt-BGL I-1、Nt-BGL I-3参与了‘平潭水仙’挥发性芳香物质形成过程，Nt-BGL I-2、Nt-BGLⅢ-1参与了β-葡萄糖苷酶其他生理代谢；萜类合成酶众多，本论文所获得的芳樟醇合成酶基因(Nt-Lis I)可能并不是参与芳樟醇合成途径的关键基因家族成员。

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第一章 绪 论

1 国内外研究现状

2 研究目的与意义

3 研究内容与目标

4 研究技术路线

第二章 ‘平潭水仙’不同时期挥发性成分的

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 ‘平潭水仙’不同时期键合态、游离态挥发性成分的变化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 ‘平潭水仙’不同时期β-葡萄糖苷酶活性测定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 β-葡萄糖苷酶同源克隆及生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 ‘平潭水仙’芳樟醇合成酶基因克隆和生物信息学分析

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第七章β-葡萄糖苷酶基因家族及花香基因的定量表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第八章 总结与展望

1 结论

2 特色与创新点

3 展望

参考文献

附录1 不同时期的‘平潭水仙’

附录 2 Nt-BGL I-1、Nt-BGL I-2、Nt-BGL I-3、Nt-BGLⅢ-1、Nt-Lis I序列信息

致谢