小菜蛾抗菌肽moricins基因的克隆及功能鉴定

摘要

昆虫为了抵御病原物的入侵，进化出一套完整的免疫效应因子。抗菌肽（AMPs）是杀灭或者抑制入侵病原物的一类重要免疫效应因子，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物的天然免疫系统中。大部分抗菌肽是由12~50个氨基酸残基组成的阳离子小分子多肽，具有广谱的抗菌活性，在天然免疫系统中扮演着重要的角色。小菜蛾是危害十字花科植物的世界性害虫，阐明小菜蛾抗菌肽的功能，可以为小菜蛾抗菌肽的应用研究提供理论基础，从免疫系统的角度为小菜蛾的综合防治提供新的视角和方向。本研究从小菜蛾体内克隆得到小菜蛾抗菌肽moricins基因，利用硫氧还原蛋白（Trx）作为融合标签，以大肠杆菌作为表达系统，成功表达小菜蛾抗菌肽moricins，进一步深入研究小菜蛾moricins的生物学活性、分子结构，并探讨了小菜蛾moricins结构与功能之间的关系。具体研究结果如下：
　　本文从小菜蛾中克隆得到3个moricins基因PxMor1、PxMor2和PxMor3的cDNA全长序列，序列分析发现，小菜蛾moricins基因的ORF（open reading frame）长度为198 bp，编码65个氨基酸的前体蛋白，包括42个氨基酸的成熟肽，其中PxMor1和PxMor2编码的成熟肽序列完全一样。利用大肠杆菌表达系统，采用融合表达策略，成功表达并纯化得到2个抗菌肽PxMor2和PxMor3。使用圆二色谱法对两个多肽的结构进行分析，结果表明两个小菜蛾抗菌肽 PxMor2和PxMor3在水溶液中主要以无规卷曲构象存在，而在膜类似环境中却以典型的α-螺旋的构象存在。抑菌活性实验表明 PxMor2不仅对革兰氏阴性的大肠杆菌（Escherichia coli）具有较强的抑菌活性，而且对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也有很强的抑菌活性；然而，PxMor3仅对革兰氏阴性的大肠杆菌（Escherichia coli）具有较强的抑菌活性。进一步的研究表明，抗菌肽PxMors的N-端α-螺旋部分的10、14和17号位氨基酸的突变会导致PxMors的活性改变。利用扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜深入研究抗菌肽 PxMors的抑菌作用机理，结果表明抗菌肽PxMors通过作用于细菌的细胞膜，破坏细胞膜结构从而杀灭或抑制细菌的生长。
　　本研究不仅阐明了小菜蛾抗菌肽moricins的抗菌活性、抗菌机理，同时探讨了moricins结构与功能之间的关系，对促进小菜蛾免疫防御系统的认识，为小菜蛾抗菌肽moricins的应用研究奠定了理论基础，同时也为抗菌肽的分子设计提供新的思路。

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前言

1 昆虫免疫系统简介

1.1 昆虫的细胞免疫

1.2 昆虫的体液免疫

2 昆虫抗菌肽的研究

2.1 昆虫抗菌肽的分类

2.2 昆虫抗菌肽的活性

2.3 昆虫抗菌肽的作用机理

3 小菜蛾抗菌肽的研究概况

3.1 小菜蛾及其免疫系统的研究

3.2 小菜蛾抗菌肽的研究

4 本研究的目的和意义

第一章 小菜蛾抗菌肽moricins基因的克隆及分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 小菜蛾幼虫总RNA的电泳分析

2.2 小菜蛾moricins的PCR产物

2.3 重组质粒pEASY-PxMors的PCR鉴定结果

2.4 Moricins基因的序列分析

2.5 Moricins成熟肽的理化性质

3 小结与讨论

第二章 小菜蛾抗菌肽moricins基因的表达纯化

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 Moricins成熟肽的PCR产物

2.2 Moricins融合蛋白的诱导及纯化结果

2.3 Moricins融合蛋白的酶切分析及目的肽的纯化结果

2.4 PxMor2和PxMor3的分子量

2.5 PxMor2和PxMor3的二级结构

3 小结与讨论

第三章 小菜蛾抗菌肽moricins基因的功能鉴定

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 小菜蛾moricins的抗菌活性

2.2 小菜蛾moricins的抑菌机理

3 小结与讨论

第四章 总结

参考文献

附录

致谢