甜菜夜蛾抗菌肽基因moricin的克隆和表达

摘要

本文通过大肠杆菌JM109诱导甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)幼虫，用FastTrack(R)试剂盒提取诱导幼虫脂肪体mRNA，反转录合成cDNA，根据GenBank登录的moricin序列(No.AY611631)设计特异性PCR引物扩增获得了甜菜夜蛾的抗菌肽基因moricin。计算机软件分析表明，moricin编码区长204bp，编码67个氨基酸，预期分子量为7.2kDa，SignalP预测结果显示，在Moricin的起始密码子开始的氨基酸序列中有信号肽存在，可能的切割位点是第24和25位残基之间，Blast比较Moricin蛋白与其他鳞翅目昆虫的Moricin蛋白后发现，甜菜夜蛾Moricin蛋白与斜纹夜蛾(Spodopteralitura)、家蚕(Bombyxmori)、烟草天蛾(Manducasexta)、化香夜蛾(Hyblaeapuera)以及烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)Moricin蛋白的一致性分别为98％、69％、79％、69％和76％。另外利用actin的管家基因特性来作为转录的阳性对照研究moricin的转录情况，转录时相分析发现，moricin有本底转录，而且转录持续到12h；组织特异性转录分析发现，moricin在血细胞、脂肪体、中肠、上皮等组织中都有转录。 参照Moricin类抗菌肽由42个氨基酸残基组成，以及计算机软件分析结果发现Moricin有24-25个氨基酸长度的信号肽序列的特点，通过设计引物，用PCR的方法从甜菜夜蛾moricin序列中获得了C-末端42个氨基酸，分子量大小为4.6kDa的DNA片段，并与斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituranucleopolyhedrovirus，SpltMNPV)泛素基因融合，将融合片段克隆至原核表达质粒pQE30，构建了重组表达质粒pQE-SeMU。重组表达质粒转化大肠杆菌M15，经IPTG诱导，Western印迹分析表明，融合蛋白的大小为15kDa，与预期大小一致，表明该融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。融合蛋白的可溶性分析表明，目的蛋白为可溶；用6×His蛋白纯化试剂盒非变性纯化后，获得一条特异的蛋白带，大小与预期分子量一致，泛素蛋白水解酶酶切融合蛋白后，初步抗菌活性测定显示，Moricin对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)有较强的抑制活性。 为了进一步研究不同表达载体之间对moricin的表达效率的影响，进行了Moricin的C-末端42个氨基酸与GST(glutathione-S-transferance)的融合表达。Western免疫分析表明，该融合蛋白能与GST抗体反应，大小与预期一致，证明该融合蛋白表达正确。可溶性分析表明目的蛋白为可溶，GST纯化柱洗脱的目的带高度特异，用凝血酶酶切后没有发现Moricin的抗菌活性，可能与在凝血酶酶切的过程中Moricin的降解有关，有关结论需要进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

前言

第1章昆虫抗菌肽的研究进展

第2章 甜菜夜蛾抗菌肽moricin的克隆及其序列分析

第3章抗菌肽moricin与泛素基因的融合表达

第4章抗菌肽moricin与GST载体的融合表达

结论

展望

参考文献

致谢

原创性声明