18个野生灵芝菌株的分离鉴定及其特性研究

摘要

灵芝(Ganoderma lucidum)，属真菌界（Kingdom Fungi），担子菌门（Basidiomycota），担子菌纲（Basidiomycetes），多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，灵芝属(Ganoderma)。在我国已经有两千多年的药用历史，被中医家视为补中益气、滋补强体、扶正固本、延年益寿等功效的上等良药。
　　本研究对采集自福建、广东、广西、江苏、吉林的野生灵芝进行分离鉴定和药用成分分析。对野生灵芝菌株进行ITS鉴定，分析其生物学特性和遗传亲缘关系，研究菌株有效成分含量的差异，比较栽培和野生灵芝子实体的差异，挖掘利用灵芝的价值。本研究主要做了以下工作：
　　1本研究从福建、广东、广西、江苏、吉林采集分离了18个野生灵芝菌株，其子实体形态可分为4类，可能为赤芝、紫芝、重伞灵芝和弯柄灵芝（或喜热灵芝或海南灵芝）。采用ITS测序初步分类鉴定，结果发现野生灵芝菌株的ITS序列片段大小在500-750 bp，可以分为6大类：G. lucidun（赤芝）9个、G. sinense（紫芝）2个、G. tsugae（松杉灵芝）1个、G. flexipes（弯柄灵芝）1个、G. multipileum（重伞灵芝）3个以及G. sp2个。
　　2对野生菌株进行ITS-RFLP和ISSR分子标记分析。分别用HaeIII和MspI酶切ITS序列，结合克隆测序得到ITS序列的酶切片段，将18个灵芝菌株分为6类，结果和ITS的聚类一致。用筛选出的8个ISSR引物分析收集的灵芝，构建亲缘关系图谱，结果表明亲缘系数为0.7时，菌株被分为6大类，呼应了ITS聚类和ITS-RFLP分类结果。同时发现菌株SL9和SL10是相同菌株，验证两者无拮抗反应；亲缘系数为0.64时，G. sp与G. lucidun聚为一类。赤芝的亲缘关系表明，地理距离近的菌株亲缘关系较近。
　　3分析野生灵芝菌株的生物学特性，发现不同灵芝菌种的差异较大。G.tsugae和G. sp的菌丝形态与其他菌种区别明显；无论在PDA培养基还是木屑培养基中，G. multipileum的生长速度都是最快的，G. tsugae和G. flexipes的均很慢。生长温度结果表明，G. tsugae的适温是20℃，为耐低温菌株；G. multipileum-Y1的适温是34℃，为耐高温菌株。赤芝种内，菌株WX和NZ的适温也是34℃，生长速度快，且菌株NZ比较耐酸性生长，可作为遗传育种材料。
　　4灵芝野生菌株和主栽品种出芝试验，比较不同灵芝菌株的农艺性状，发现不同灵芝菌种的子实体形态大同小异。G. multipileum的菌株LQ和Y1单袋产量较高，且菌株LQ的产孢量较高，菌盖似如意，适合栽培驯化；G. flexipes和G. sp的产量一般；但G. tsugae和G. sinense未如期出芝。赤芝的单袋产量高，其中菌株ZK最高，达17.60 g；赤芝菌株SL9和SL6的产量较高，且SL6周期短，产孢量多，可进一步观察作为育种材料。
　　5比较灵芝子实体有效成分含量，G. flexipes-SC子实体多糖和三萜含量高，其中多糖含量为23.70 mg/mL，但是三萜酸成分和含量较少；G. sp-YX和G. sp-ZJ的子实体三萜含量高，且三萜酸成分和含量都极丰富，可用于多糖或三萜的提取生产。此外，研究发现子实体三萜的HPLC图谱可用于G. flexipes、G. multipileum、G. lucidun和G. sp的鉴定分类。赤芝菌株中，产量高的菌株ZK三萜含量高且三萜酸含量及成分丰富，但多糖含量较低，适合推广栽培；菌株SL9的灵芝酸A含量较高，多糖含量居中；菌株yx和SL4的多糖和三萜含量均较高，可进行开发利用。
　　6比较相同菌株的野生采集和人工栽培子实体有效成分含量，野生子实体多糖和三萜含量分别为栽培子实体含量的87％以内和75%左右，而且野生子实体的安全存在不稳定性，表明栽培灵芝子实体更适合服用。
　　7通过摇瓶培养，得到G. multipileum-Y1的生物量最高，为1.226 g/100mL；发酵液多糖结果显示G. multipileum-Y1和G. sp-YX的含量较高；菌丝三萜以G.multipileum的菌株LJ和Y1及G. sp-ZJ的较高，其中G. multipileum-LJ最高，为15.72 mg/g。结合以上研究得出：G. multipileum-Y1生长速度快，菌丝生物量高，菌丝三萜和发酵液多糖含量都很高，适合作为液体深层发酵菌株。另外HPLC图谱表明，因菌丝的三萜酸含量极低，无法对不同菌种进行区别分类。赤芝菌株中SL4的生物量较高；WX的菌丝三萜含量高于12.30 mg/g，可进一步开发。