牛樟芝MVA途径中基因克隆及转录组、代谢组研究

摘要

我国是食、药用菌生产大国，牛樟芝（Antrodia cinnamomea）是我国台湾著名药用菌品种，富含三萜、腺苷、多糖等活性物质，具有增强免疫力、降血糖、抗过敏、保肝等多种功效。本课题对牛樟芝遗传转化体系构建、牛樟芝菌丝体液体发酵培养基优化、牛樟芝MVA途径中基因克隆和表达量以及牛樟芝子实体、菌丝体转录组和代谢组进行了研究，为进一步认识牛樟芝MVA途径和相关代谢途径中物质差异、解决牛樟芝工业生产瓶颈问题。主要结论如下：
　　第一，牛樟芝菌丝体在固体和液体培养基中生长速度均呈先上升后下降的趋势，在28℃，液体培养120 rpm·min，21~28 d时生物量达到最佳。收集生长14 d的新鲜牛樟芝菌丝体经10 mg·mL-1溶壁酶在30℃酶解4 h后，原生质体得率达3.55×105个·mL-1，且再生率达4.59％；20~40%PEG-CaCl2均可介导牛樟芝原生质体转化，当40%PEG时转化效率最高。用荧光显微镜和PCR对含GFP标记及潮霉素抗性的拟转化子进行验证，结果证实该方法可将外源基因整合到牛樟芝基因组中。
　　第二，利用PB实验、最陡爬坡实验和RSM实验筛选液体培养牛樟芝菌丝体生物量培养基和牛樟芝菌丝体富萜培养基。结果表明，实际生产中牛樟芝菌丝体生物量最适培养基为35.16 g·L-1葡萄糖，42.86 g·L-1麦芽糖，20.80 g·L-1酵母提取物，0.39 g·L-1VB1，0.85 g·L-1壳聚糖，当温度为28℃，转速为120 rpm·min-1，培养15 d后菌丝体生物量为1.6765±0.0103 g·100 mL-1（DW）；筛选牛樟芝菌丝体富萜最适培养基为：10.32 g·L-1葡萄糖，42.58 g·L-1麦芽糖，15.37 g·L-1蛋白胨，1.12 g·L-1MgSO4，0.63 g·L-1KH2PO4，0.55 g·L-1菌草灵芝水提取物（JCGLWE），当温度为28℃，转速为120 rpm·min-1，培养15 d后菌丝体三萜含量为34.03±1.264 mg·g-1（DW）。
　　第三，利用简并引物对牛樟芝的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（mvd）和鲨烯环氧酶（se）基因进行RACE扩增，gDNA全长分别为1268 bp和1607 bp，分别内含1个和3个内含子，cDNA序列分别编码402氨基酸和481氨基酸，并对序列进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析不同形态及培养阶段牛樟芝中mvd和se表达水平，结果表明培养7 d后菌丝体中mvd和se的表达量均达到最高，但随着培养时间的延长而呈下降趋势，培养28~42 d后菌丝体中两基因表达量趋于稳定；菌丝体中三萜含量的测定结果表明，当培养时间小于28 d时，菌丝体中三萜含量随着培养时间的延长而逐渐增加，且培养28 d时菌丝体的三萜含量最高，达39.192±2.025 mg·g-1，仅次于牛樟芝子实体三萜含量（49.391±2.675 mg·g-1），但菌丝体生长28 d后其三萜含量降低，玉米芯栽培的牛樟芝子实体三萜含量最低（为11.530±0.733 mg·g-1），各样品与对照组间三萜含量差异达到显著水平。
　　第四，对牛樟芝子实体（样品1号）、液体培养14 d牛樟芝菌丝体（样品2号）和液体培养28 d牛樟芝菌丝体（样品3号）的转录组GO及KEGG分析结果表明，基因表达差异分析结果显示样品1号与样品2号间差异基因有324个，富集在83条GO-term中，其中307个为下调基因，17个为上调基因；样品1号和样品3号间差异基因有271个，富集在78条GO-term中，其中245个为下调基因，26个为上调基因；样品2号与样品3号间存在的差异基因为337个，富集在46条GO-term中，其中244个为上调基因，93个为下调基因。KEGG结果表明子实体和菌丝体主要差异代谢途径集中在碳代谢、氧化磷酸化、三羧酸循环、糖酵解、氨基酸生物合成等，而菌丝体间的差异代谢主要集中在脂肪酸代谢、NOD受体信号通路、PPAR信号通路等。结果说明不同形态牛樟芝间的碳代谢、氨基酸代谢发生了异常；而不同培养时间的菌丝体之间的脂肪酸代谢和各种信号通路发生了紊乱，其中以脂肪酸代谢变化最为明显。此外，从转录组测序结果中筛出2个较稳定表达基因作为管家基因，并对三萜途径中的差异基因验证。
　　第五，对牛樟芝子实体（样品1号）、液体培养14 d牛樟芝菌丝体（样品2号）和液体培养28 d牛樟芝菌丝体（样品3号）的代谢组分析结果表明，样品1号与样品2号中筛选出正负离子条件下已鉴定的代谢差异物分别为21种和26种；样品1号与样品3号中筛选出正负离子条件下已鉴定的代谢差异物分别为14种和28种；样品2号与样品3号中筛选出正负离子条件下已鉴定的代谢差异物分别为20种和29种。子实体与菌丝体主要代谢差异途径包括氨基酸合成代谢、碳代谢和糖代谢，两者间的共同差异代谢物共47种；而菌丝体间主要代谢差异途径包括氨基酸合成和脂肪酸代谢，两者间差异代谢物共43种。研究发现，子实体与菌丝体间在负离子条件下特有潜在生物标记物有粪卟啉Ⅲ二盐酸盐（Coproporphyrin III）、NG,NG-二甲基-L-精氨酸（NG）、咪唑（Imidzaole）、乙酰基葡萄胺脱氢酶（UDP-N-acetylglucosamine）、尿苷二磷酸葡萄糖（Uridine diphosphate glucose）、鸟氨酸（Ornithine）6种，不同培养时间菌丝体之间负离子条件下特有潜在生物标记物为 D-半乳糖，苷氨羧酸，β-D-果糖-2-磷酸盐3种。
　　本文围绕牛樟芝MVA途径进行相关研究，通过液体发酵培养基筛选、基因克隆及表达、转录组和代谢组等方法综合探讨牛樟芝三萜类化合物合成途径，研究结果为进一步挖掘牛樟芝三萜合成关键基因提供科学依据和理论基础，也为工业化生产牛樟芝菌丝体提供参考。

目录

声明

缩略词

第一章 引言

1.1 牛樟芝国内外研究现状

1.2 牛樟芝三萜类化合物研究进展

1.3 转录组学研究进展

1.4 代谢组学研究进展

1.5 本研究内容及意义

第二章 牛樟芝菌种鉴定及遗传转化体系的构建

2.1 材料与仪器

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 响应面筛选牛樟芝菌丝体液体培养基的研究

3.1 材料与仪器

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 牛樟芝中甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、鲨烯环氧酶基因克隆及表达分析

4.1 材料与仪器

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 不同培养时间牛樟芝菌丝体和子实体转录组的研究

5.1 材料与仪器

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 不同培养时间牛樟芝菌丝体和子实体代谢组的研究

6.1 材料与仪器

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

6.5 小结

第七章 全文总结与展望

7.1 全文总结

7.2 创新点

7.3 本研究不足

7.4 展望

参考文献

附录

相关成果

致谢