基于RNA-seq的蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的免疫应答研究

摘要

白垩病是一种最具代表性的蜜蜂真菌病，该病由蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis，简称球囊菌）特异性侵染蜜蜂幼虫而导致，严重危害养蜂生产。意大利蜜蜂（意蜂）幼虫极易被球囊菌侵染而罹患白垩病，而中华蜜蜂（中蜂）幼虫的球囊菌抗性较强。前期球囊菌的研究主要涉及分类鉴定、培养方法、病原检测、流行病学、侵染过程以及免疫防御等方面，由于参考基因组信息的缺失，球囊菌的分子研究进展缓慢。相关研究主要集中在球囊菌侵染意蜂幼虫的诸多方面，有关球囊菌侵染中蜂幼虫的研究非常滞后。目前，白垩病的组学研究极其有限，有关蜜蜂幼虫响应球囊菌胁迫的转录组学研究未见报道。因此，本研究用107孢子/mL的球囊菌纯化孢子饲喂感染意蜂及中蜂幼虫，利用 RNA-seq技术对对照组和处理组蜜蜂幼虫肠道进行深度测序，首先组装并注释中蜂幼虫肠道的参考转录组，进而对两种蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的免疫应答进行深入分析，获得的主要结果如下：
　　（1）首次通过形态学和分子生物学手段证实从自然蜂群中的中蜂白垩状幼虫尸体上分离的病原为球囊菌，且中蜂幼虫可在实验室条件下通过饲喂接种球囊菌而发生白垩病。
　　（2）成功组装并注释中蜂幼虫肠道参考转录组，可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息；基于此转录组数据开发出21个中蜂幼虫的SSR分子标记，可应用于中蜂及其幼虫的基因图谱构建、基因多样性分析以及基因定位等研究，同时说明利用转录组数据大规模开发非模式生物的 SSR是一种高效快速的可行途径。
　　（3）通过中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫过程中的差异表达基因（DEGs）分析和趋势分析，发现富集在细胞免疫通路的 DEGs中表现为上调趋势的基因数远多于下调趋势，富集在体液免疫通路的DEGs均表现为上调趋势，表明宿主的细胞和体液免疫通路均被球囊菌显著激活，全面解析了中蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的免疫应答。
　　（4）通过意蜂幼虫在球囊菌胁迫过程中的 DEGs分析和趋势分析，发现富集在细胞免疫通路上的部分DEGs表现为上调趋势，而更多DEGs表现为下调趋势，富集在体液免疫通路上的绝大多数DEGs表现为上调趋势，表明宿主的细胞免疫通路被部分激活，而体液免疫通路被显著激活，全面解析了意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的免疫应答。

目录

声明

第一章 引言

1 蜜蜂疾病

2 蜜蜂抵御病原的机制

3 高通量测序技术及昆虫研究中的应用

4 研究目的及意义

第二章 中华蜜蜂白垩状幼虫尸体病原的分离培养与鉴定

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记开发

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 中蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的免疫应答研究

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的免疫应答研究

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 结论

参考文献

附录

攻读学位期间的学术论文与研究成果

致谢