青花菜BZR1、BES1转录因子的克隆与功能分析

摘要

青花菜（Brassica oleracea var.italica）是发达国家进口量最大的蔬菜之一，含有迄今为止在蔬菜中发现的抗癌活性最强的天然活性物质—萝卜硫素（Sulforaphane）。萝卜硫素的合成前体是芥子油苷（Glucosinolate），是一种含氮和硫的次生代谢物，其广泛存在于十字花科植物中，对植物响应生物或非生物胁迫具有很重要的作用，且其部分降解产物对人体具有很强的保健功能。因此，其合成调控分子生物学近年来逐渐成为研究热点。油菜素内酯（Brassinosteroids,BRs）作为植物特有的一类类固醇激素，广泛参与植物生长发育和响应环境的过程。BZR1（brassinazole-resistant1）和BES1（BRI1-EMS-suppressor）是油菜素内酯信号转导途径中的两个重要转录因子，已在拟南芥中证实油菜素内酯可以通过BZR1和BES1抑制植物体内芥子油苷的生物合成。萝卜硫素和芥子油苷在青花菜中含量最为丰富，BZR1和BES1转录因子是否影响其在青花菜中的合成以及如何影响？目前尚不清楚。为此，本研究从青花菜中克隆了BZR1和BES1基因，并进一步分析了其表达模式和功能。
　　本研究主要内容包括：⑴根据青花菜同属（芸苔属）物种的BZR1和BES1转录因子核苷酸序列，设计特异性引物，通过RT-PCR技术，从高萝卜硫素青花菜“福青1号”叶片cDNA中扩增得到油菜素内酯信号转导途径中的转录因子BZR1和BES1的同源序列，其长度分别为993bp、1011bp，分别编码330和336个氨基酸，并分别命名为BoBZR1和BoBES1。生物信息学分析发现，克隆的这两个基因的核苷酸序列与NCBI上已登录的其他物种的同类基因相似性较高，含有典型的 N末端结构域和C末端转录激活结构域。初步确定它们为青花菜BoBZR1和BoBES1基因。⑵分别构建了BoBZR1和 BoBES1基因的亚细胞定位载体pEGAD-BoBZR1和pEGAD-BoBES1，并转化本氏烟草中进行瞬时表达。结果表明，BoBZR1和BoBES1蛋白定位在几乎整个细胞中，当外源喷施 BR后，融合蛋白全部集中在核内，表明植物细胞接收到BR信号后，转录因子BoBES1和BoBZR1被激活，进入细胞核内部行使功能。⑶qRT-PCR分析表明，BoBZR1和BoBES1基因在根中表达量均最高，在花球中最少，在种子中几乎都检测不到。当对其叶片进行外源喷施500μM的甲基茉莉酸甲酯（MeJA）、5 mM的水杨酸（SA）和3μM的BR后，青花菜中BZR1和BES1基因的表达量分别在处理24 h、8 h、24 h后达到最大值；在处理48 h后，除了BR处理组的基因表达量稍微降低，其他两种处理均趋于初始状态。⑷构建了以35S启动子驱动BoBZR1和BoBES1基因表达的植物超表达载体pBI-BoBZR1和pBI-BoBES1，并转化到野生型拟南芥Col-0中。对T3代转基因拟南芥纯合体的表型分析和芥子油苷含量检测发现：两种基因超表达植株均出现植株矮小以及发育迟缓的表型，而BoBES1基因超表达受到的影响更大，叶片变小且出现卷叶。与野生型拟南芥Col-0相比，BoBZR1和BoBES1基因超表达都会降低拟南芥中短链脂肪族芥子油苷（3MSOP、4MSOB、5MSOP、4MTB）和长链脂肪族芥子油苷（8MSOO）的含量，其中 BoBES1基因超表达显著降低拟南芥中芥子油苷的含量。结果说明BoBZR1和BoBES1基因的表达对芥子油苷的合成具有显著的抑制作用。⑸构建了BoBZR1和BoBES1基因的干扰表达载体，并与上述超表达载体一起分别转化到青花菜中，已获得T0代抗性苗110株，其中转BZR1和BES1基因干扰表达载体的植株分别28株和26株，转超表达载体的植株均28株。

目录

声明

第一章 文献综述

1青花菜简述

2 油菜素内酯的研究进展

2.1 油菜素内酯的生物合成与代谢

2.2 油菜素内酯的生物学功能

2.3 油菜素内酯的信号转导途径

3 芥子油苷的合成调控

4 本研究的目的和意义

第二章 青花菜转录因子BZR1、BES1的克隆与表达分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 生化试剂

1.3 仪器

1.4 方法

2 结果与分析

2.1青花菜BZR1、BES1基因的克隆

2.2青花菜BZR1、BES1基因的生物信息学分析

2.3 青花菜BoBZR1、BoBES1基因的组织特异性表达分析

2.4 青花菜BoBZR1、BoBES1基因的诱导表达分析

3 讨论

第三章 青花菜BoBZR1、BoBES1基因的功能分析

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 方法

2 结果与分析

2.1青花菜BoBZR1、BoBES1基因亚细胞定位分析

2.2 拟南芥遗传转化

2.3 青花菜遗传转化

3 讨论

第四章 总结与展望

1 总结

2 展望

参考文献

致谢