甘蔗部分磷素响应关键基因的克隆及表达分析

摘要

磷素作为甘蔗生长发育的必需肥料元素之一，在甘蔗生长发育的各个阶段起着至关重要的作用，如适量施磷不仅可以促进甘蔗根、茎、叶等组织器官的形态建成，而且可以有效改善甘蔗茎径、有效茎数、单茎重，进而贡献于甘蔗产量的增加。研究者们对我国多个蔗区调查研究发现，大部分蔗区的有效磷含量仍处于中等以下水平，且蔗区的磷素利用效率也相对低下，仅为6.7％-15.3%。近年来，人们通过对一些模式植物拟南芥、水稻进行研究发现，通过分子手段进行磷高效种质材料的改良、创新可大大改善植物自身磷素利用率过低这一现状。
　　本研究以转录组测序建立的unigene数据库为基础，对其中参与甘蔗磷素响应调控基因进行发掘。并以转录组测序所获序列为模板，设计特异性克隆引物，对其中的部分关键基因完成克隆和表达模式分析。旨在揭示甘蔗磷素响应调控过程的相应基因，为下一步进行磷高效甘蔗种质创新和筛选鉴定奠定基础。主要结果与结论如下：
　　1.应用转录组测序建立的unigene数据库对甘蔗磷素响应调控基因完成注释，从中我们共注释出130条unigene信息，它们分别编码甘蔗的ScPHR1-3（7条）、ScSPX1-6（12条）、ScPAP2（4条）、ScPHT1（13条）、ScPHO1;1-1;3（5条）等75个基因。
　　2.应用PCR克隆手段对其中注释为甘蔗的ScPHR1-3、ScSPX1-6完成克隆。克隆结果显示，甘蔗的ScPHR1基因cDNA序列全长1539bp，编码442个氨基酸；ScPHR2基因cDNA序列全长1520bp，编码417个氨基酸；ScPHR3基因cDNA序列全长1351bp，编码393个氨基酸；ScSPX1基因cDNA序列全长1639bp，编码310个氨基酸；ScSPX2基因cDNA序列全长2050bp，编码278个氨基酸；ScSPX3基因cDNA序列全长892bp，编码259个氨基酸；ScSPX4基因cDNA序列全长1893bp，编码336个氨基酸；ScSPX5基因cDNA序列全长889bp，编码262个氨基酸；ScSPX6基因cDNA序列全长1533bp，编码260个氨基酸。
　　3.ScPHR1-3及ScSPX1-6基因编码蛋白一级结构预测结果显示，它们均属于亲水性，不稳定蛋白。等电点预测分析，除ScSPX3蛋白呈碱性外，其余的均呈现酸性。结构域分析结果表明，ScPHR1-3均属于 MYB-CC基因家族，有且都包含有 MYB-DNA结合域和Coil-colied(CC)结合域；ScSPX1-6均属于SPX大家族,且都含有一个SPX结构域。同源比对和遗传进化分析结果表明，甘蔗与高粱有着较近的遗传关系，其次是玉米、水稻等。蛋白二级结构预测结果表明，甘蔗ScPHR1-3及ScSPX1-6蛋白均不含跨膜结构；且在功能预测结果呈现一致性，均为转运和锚定。上述预测结果与水稻、拟南芥等植物分离出的该基因特征极为相似。
　　4.以甘蔗的根、茎、叶、芽为组织材料，应用qRT-PCR技术对甘蔗ScPHR1-3、ScSPX1-6基因组织特异性表达进行分析。结果显示，甘蔗的这9个基因在甘蔗的不同组织部位中均有表达。对PHR基因家族表达特征具体分析发现，ScPHR1在根中的表达量最低，其次是茎、叶、芽；ScPHR3基因在茎中的表达量最低，其次是根、叶、芽；ScPHR2在根中的表达量最低，其次是茎、芽、叶。而对SPX基因家族分析显示，其中除ScSPX6在芽中的表达量最低外，其余的基因均在根中的表达量为最低。除ScSPX1在叶中的表达量最高外，其余的均在茎中的表达量最高。
　　5.对甘蔗ScPHR1-3基因亚细胞定位分析发现，该基因家族中的ScPHR1和ScPHR2定位于烟草表皮细胞的细胞核内，ScPHR3定位于烟草表皮细胞的细胞膜和细胞质上。对ScSPX1-6基因亚细胞定位分析发现，ScSPX1和ScSPX2定位于烟草表皮细胞的细胞核内；ScSPX3和ScSPX6定位于烟草表皮细胞的细胞膜和细胞质上；ScSPX4和ScSPX5定位于烟草表皮细胞的细胞膜和细胞核上，且ScSPX5在细胞质中也有所表达。结合结构和功能预测分析，ScPHR1和ScPHR2，ScSPX1和ScSPX2基因可能参与细胞核内物质的转运和锚定，而其他基因在这一特征上均呈现为多样性，如它们均在细胞膜上有表达，表明它们可能参与细胞膜内外的转运和锚定，且ScSPX3、ScSPX5、ScSPX6还在细胞核内被发现，表明它们还可能参与细胞内核质间的物质转运与锚定。此外，ScPHR3、ScSPX4与ScSPX5在胞质中也存在有一定的表达，因此，我们推测它们还可能参与细胞器间物质的交流。
　　6.原核表达分析结果表明，这9个基因在18℃用0.5mM IPTG进行诱导表达10h后均能表达目的蛋白。其中ScPHR1-3经诱导后的目的蛋白大小约为53KDa、50.5KDa和48KDa；而ScSPX1-6经诱导后的目的蛋白大小约为39.5KDa、37KDa、33KDa、42KDa、33.5KDa、36KDa；融合标签大小为4.5KDa。该表达检测结果与之前预测蛋白大小相符。同时，表达所获蛋白为进一步对该基因进行功能作用的探讨奠定基础。

目录

声明

第一章 综述

1 研究背景

2 研究现状

3 本研究立论依据及研究意义

4 技术路线

第二章材料与方法

1 材料

2 药品与试剂

3 实验方法

第三章 结果与分析

1 甘蔗磷素调控基因的注释

2 甘蔗ScPHR1-3及ScSPX1-6基因的克隆

2 基于甘蔗ScPHR1-3和ScSPX1-6基因的生物信息学分析

3 组织特异性表达分析结果

4 亚细胞定位分析结果

5 原核表达分析结果

第四章 讨论与展望

1 讨论

2 展望

参考文献

附录

附录A 甘蔗转录组数据库中磷素响应调控基因的注释

附录B 甘蔗样品材料RNA的提取及cDNA第一链的合成

附录C 本研究中所用引物信息

附录D 本研究中克隆所获序列

致谢