小菜蛾GSS响应寄主植物硫苷表达的分子机制

摘要

硫代葡萄糖苷（简称硫苷）是十字花科植物中普遍存在的防御物质，能够被植物体内的黑芥子酶水解为对昆虫有毒的水解产物。十字花科植物专食性昆虫小菜蛾，能通过自身的硫代葡萄糖苷硫酸酯酶与黑芥子酶竞争结合并水解底物硫苷，达到解毒的作用。小菜蛾在幼虫时期能够大量取食十字花科植物并接触硫苷，前期研究也发现小菜蛾硫代葡萄糖苷硫酸酯酶基因（GSS）及其修饰因子基因（SUMF）在幼虫中肠协同高表达。本研究在此基础上，拟进一步探明小菜蛾GSS与SUMF的表达是否能够响应硫苷的调控，并寻找其响应硫苷的顺式调控元件和相关转录因子。主要结果如下：
　　1.使用不同浓度丙烯基硫苷（SIN）及其代谢产物异硫氰酸烯丙酯（AITC）处理的人工饲料和萝卜苗叶片，饲喂小菜蛾3龄幼虫48 h后，通过qPCR检测GSS和SUMF在虫体和中肠的表达水平。结果显示，小菜蛾幼虫取食AITC处理的人工饲料和萝卜苗叶片，以及经三种浓度SIN处理的叶片后，目的基因的表达均未呈现明显的变化规律。但取食三种浓度SIN处理的人工饲料48 h后，小菜蛾幼虫GSS1的表达受到显著诱导。经25μg/μL SIN处理48 h后小菜蛾幼虫中肠的GSS1表达情况与整虫相符。
　　2.从FZ、HN和G88三种品系小菜蛾基因组中克隆到了4个类型的GSS1启动子，G88和HN品系的GSS1启动子相对于FZ品系，在转录起始位点（TSS）上游约-540~-1200 bp区域内存在较大片段的缺失或碱基突变。此外，从 FZ品系中也克隆得到了4个类型的SUMF1a启动子，它们也在TSS上游约-1700~-2200 bp区域内存在较大片段插入或缺失。这说明这两个基因的启动子在不同小菜蛾个体中均具有一定的多态性。同时也发现这些启动子上均含有多个AT富集序列，这可能对基因转录调控产生影响。
　　3.利用生物信息学方法预测发现，GSS1和SUMF1a基因的5′端上游区域均含有Bcd、En、Dfd、Eve、Hb和SGF-3等多个潜在的转录因子结合位点。其中 ER结合位点保守存在于不同基因型的 GSS1和 SUMF1a启动子中靠近转录起始位点处。我们通过将不同长度的GSS1启动子与IE1启动子和EGFP报告基因连接构建表达载体，并在转染Sf9细胞后进行SIN处理，鉴定受SIN调控的相关元件。使用ImageJ软件对荧光图片进行半定量分析发现，在转录起始位点上游-1702~-874之间可能存在响应SIN的作用元件；但经由qPCR检测EGFP表达量则发现，SIN会抑制本底IE1启动子活性，难以直接判定SIN能否影响GSS1启动子的活性，但能够推测在-412~+36之间存在GSS1启动子固有的活性元件，且在-1702~-874之间可能存在响应SIN的作用元件补偿了SIN对本底IE1启动子活性的抑制作用。
　　4.进一步通过小菜蛾中肠转录组研究发现，SIN并不显著影响小菜蛾其他中肠典型解毒酶（如P450s和GSTs）活性，但能够抑制其中肠生长发育相关基因的表达，并诱导消化酶活性。也通过转录组数据筛选出并验证了上调表达的转录因子基因 Px003655，推测其可能参与小菜蛾GSS1解毒硫苷的调控进程。
　　本研究证实了小菜蛾 GSS1能够响应硫苷表达，通过分离启动子定位响应硫苷的元件，结合转录组测序技术筛选了响应硫苷的转录因子，为进一步深入研究小菜蛾响应硫苷的分子调控机制奠定了基础。本研究将有助于阐明小菜蛾与寄主植物协同进化的分子机理，为利用寄主植物抗虫性开展害虫生态防控提供理论依据。

目录

声明

1 前言

1.1 植物与植食性昆虫的协同进化

1.2 十字花科植物与植食性昆虫的互作关系

1.3 昆虫启动子研究现状

1.4 昆虫响应异源化学物质的转录组研究

1.5 本课题研究意义

2 材料与方法

2.1 供试昆虫及其饲养

2.2 硫苷及其代谢产物处理

2.3 总RNA的提取及其cDNA第一链的合成

2.4 小菜蛾基因组DNA的提取

2.5 实时荧光定量PCR

2.6 启动子片段的克隆与重组质粒的构建

2.7 细胞转染与药剂处理

2.8 细胞荧光图片半定量分析

2.9 转录组测定与差异基因验证

3 结果与分析

3.1 SIN对GSS和SUMF表达模式的影响

3.2 启动子序列的结构及特征

3.3 启动子顺式作用元件的预测与鉴定

3.4 响应SIN的转录因子筛选

4 小结与讨论

4.1 SIN处理对小菜蛾GSS和SUMF表达的影响

4.2 GSS1和SUMF1a启动子的序列多态性

4.3 GSS1启动子活性及其响应SIN的元件

4.4 小菜蛾响应SIN的中肠转录组

5 总结与展望

致谢

参考文献