文心兰离体培养优化及转化铁氧还蛋白基因研究

摘要

文心兰(Oncidium hybridum)为兰科(Orchidaceae)文心兰属植物，被插花界誉为切花“五美人”之一，具有较高的经济价值。文心兰在栽培过程中极易感染病害，尤其是由欧文氏菌(Erwinia spp)引起的软腐病(Soft rot)更是文心兰产业的毁灭性病害，但至今却仍无特别有效的防治方法，因此选育抗软腐病的文心兰品种是文心兰育种的重要方向。铁氧还蛋白（FD）作为一个大的基因家族在植物中普遍存在，现已证实Fd基因可帮助水稻、烟草、拟南芥以及文心兰在内的许多植物获得广谱抗性。本研究以文心兰‘小樱桃’为材料，利用兰花基因组数据，通过RT-PCR以及RACE技术克隆获得2条文心兰抗软腐病相关的铁氧还蛋白基因，并通过实时荧光定量PCR以及转化文心兰原球茎的研究，对这两个基因进行初步的功能验证。本研究的主要结果如下：
　　1.文心兰离体培养优化。以文心兰‘小樱桃’的PLBs为材料，研究不同添加量的香蕉泥对文心兰PLBs增殖的影响，结果表明：以1/2MS+1 g/L活性炭+50 g/L香蕉泥时增殖系数最高，高达5.41，且原球茎颜色鲜绿，长势紧密均一没有出现分化的情况；研究不同激素种类、激素浓度、自然添加物以及接种量对原球茎分化的影响，结果表明：1/2MS+50 g/L苹果泥，接种量为8团/瓶分化效果最好，分化率达到100％。可见添加物对文心兰‘小樱桃’的PLBs的分化以及细胞的增殖有明显的促进作用。
　　2.文心兰OnFd与OnFNR基因的克隆与生物信息学分析。铁氧还蛋白已被证实可以帮助许多植物获得广谱抗性，本研究基于兰花基因网站通过构建进化树，得到了7条与Fd基因亲缘关系较近的基因序列，长度分别为244、505、452、616、933、209和270 bp，其中505、452、616以及933这四条基因含有完整的ORF序列。以文心兰‘小樱桃’健康与感染软腐病的植株为材料，通过实时荧光定量PCR发现其中有两条基因在感染软腐病植株中的相对表达量呈极显著上升与下降。因此利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到这两条基因的全长序列，分别命名为OnFd（GenBank登录号为KX461907）与OnFNR（GenBank登录号为KX461908）。生物信息学分析表明：文心兰OnFd含有一个典型的[2Fe-2S]结构域，而OnFNR却包含有FAD结构域和NADP+结构域。这两个基因具有相似的磷酸化位点和空间构象等，但理化性质和跨膜结构差异明显，推测这两个基因的功能可能存在差异性。
　　3.文心兰OnFd与OnFNR基因表达模式分析。以文心兰‘小樱桃’健康植株为材料，利用实时荧光定量PCR检测OnFd与OnFNR基因在文心兰的根、假鳞茎、叶和花中均有表达。其中OnFd在花中的表达量最高，说明OnFd可能参与了植株的开花调控；而OnFNR在根中的表达量最低，而在叶中的表达量最高，其表达量约为根表达量的100倍，可见，OnFNR属于光合型的LFNR。通过对文心兰‘小樱桃’健康植株进行不同激素和非生物胁迫处理，发现OnFd与OnFNR对IAA、ABA、GA、SA、NaCl以及PEG均有响应。在IAA、GA、SA、ABA以及NaCl的处理下OnFNR呈上调趋势，只有在PEG的处理下呈下调趋势；而OnFd在IAA、SA、ABA、NaCl的处理下呈现下调趋势，在GA和NaCl的处理下表达量呈现上调趋势。无论是外源激素还是非生物胁迫均影响着OnFd与OnFNR的表达量，而这种影响可能与ROS的积累有着密切的关系。
　　4.文心兰OnFd与OnFNR基因在不同感病阶段的表达分析。以感染软腐病文心兰‘南茜’植株为材料，进行软腐病病菌分离，通过引物Y1/Y2得到一条与欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)果胶酶基因(J03673.1)相似度高达99%的病原菌DNA序列，说明引起本试验所用文心兰发病的主要病原菌为欧文氏杆菌。用所得到的软腐病病原菌对健康的文心兰‘小樱桃’进行侵染，并以感染软腐病后1d、3d、6d、9d、12d以及健康植株的根、假鳞茎、下端叶和上端叶为材料，通过荧光定量分析发现，文心兰感病后各个部位的OnFd表达量均呈上升趋势，尤其是接种部位假鳞茎在接种病原菌1 d后表达量便表现出极显著上调，并且在5个感病阶段的表达量是健康植株的2.83~3.98倍。但OnFNR在接种病原菌后上端叶、下端叶以及接种部位假鳞茎的表达量均呈现下降趋势，而根却出现了上调趋势，并在第12d达到最高值，其表达量约为对照组的4.5倍。因此无论是OnFd还是OnFNR对软腐病菌均有显著的响应，说明这两个基因可能在文心兰响应抗软腐病过程中具有重要作用。
　　5.文心兰OnFd与OnFNR蛋白的亚细胞定位分析。在获得OnFd与OnFNR的全长序列的基础上，构建融合绿色荧光1302-GFP蛋白的表达载体，并且通过农杆菌介导法使其在烟草中异位表达，观察蛋白的定位情况。结果表明：OnFd与OnFNR均定位于叶绿体。
　　6.文心兰OnFd与OnFNR基因转化文心兰。构建35S:OnFd与35S:OnFNR植物过表达载体；构建以PJM007为中间载体的OnFd RNAi与OnFNR RNAi植物抑制表达载体，并利用农杆菌介导法将其转入文心兰原球茎。结果发现转基因PLBs在抗性培养阶段生长状态不好并且颜色偏黄，但进入分化培养后颜色开始变绿并且PLBs的体积较非转基因的大。在过表达OnFd与OnFNR的PLBs中OnFd与OnFNR的表达量均呈显著上升，在抑制OnFd表达的PLBs中OnFd与OnFNR的表达量均呈极显著下降，但在抑制OnFNR表达的PLBs中OnFNR的表达量虽呈极显著下降，而OnFd的表达量却显著提高。用软腐病菌侵染经过人为切伤的转基因PLBs发现，过表达OnFd与OnFNR的PLBs较抑制OnFd与OnFNR表达的PLBs抗软腐病能力更强，这可能是因为在过表达OnFd与OnFNR的PLBs中OnFd与OnFNR的表达量均上升了。
　　SOD与铁氧还蛋白之间有着密切的关系，因此本试验通过以转基因PLBs为材料，对SOD相关基因进行实时荧光定量发现，在过表达OnFd与OnFNR的PLBs中，Cu/ZnSOD以及FeSOD的表达量均出现显著下调；当抑制OnFd与OnFNR表达时，Cu/ZnSOD的表达量出现极显著上调，而FeSOD的表达量却均出现下调情况；只有MnSOD的表达量在OnFd与OnFNR超表达以及抑制表达后均呈现显著上调情况。SOD相关基因表达量的变化可能与OnFd与OnFNR参与了植物体内的氧化还原反应有关。

目录

声明

缩写词

第一章 引言

1 文心兰离体快繁研究进展

2 文心兰转基因研究进展

3 植物Fd与FNR研究进展

4 铁氧还蛋白的在抗病作用中的研究进展

5. 本研究的意义及主要内容

第二章 文心兰原球茎离体培养优化

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 文心兰铁氧还蛋白相关基因的克隆与生物信息学分析

第一节 文心兰铁氧还蛋白（Fd）相关基因的克隆

第二节 文心兰OnFd与OnFNR基因的生物信息学分析

第四章 文心兰OnFd与OnFNR基因表达模式分析

第一节 OnFd与OnFNR基因在文心兰不同组织部位的表达模式

第二节 激素和非生物胁迫处理下文心兰OnFd与OnFNR的表达模式

第五章 文心兰OnFd与OnFNR基因在感染软腐病后不同阶段的表达模式

第一节 软腐病菌的提取与侵染

第二节 文心兰OnFd与OnFNR基因在不同感病阶段的表达模式

第六章 文心兰OnFd与OnFNR的亚细胞定位分析

1材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第七章 文心兰OnFd与OnFNR基因转化文心兰

1 材料与方法

2结果与分析

3 讨论

第八章 结论与展望

1、结论

2、展望

参考文献

附录A 图版及图版说明

附录B 文心兰OnFd与OnFNR基因cDNA序列

附录C 文心兰软腐病病原菌菌cDNA

在学硕士期间发表学术论文情况

致谢