自身淬灭荧光定量PCR检测SARS冠状病毒方法的建立

摘要

目的：应用新型的自身淬灭荧光引物(LUXPrimer)原理及技术，建立一种快速、特异、敏感和准确的定量检测SARS冠状病毒RNA的实时荧光定量RT-PCR方法。　　方法：根据已公布的SARS冠状病毒全基因序列，利用BLAST，Clustalx，RNAstructure等软件分析得到PCR扩增的靶序列。应用LUXTMDesigner软件设计引物，借助计算机辅助，分析其保守性和特异性并进行优化。通过TA克隆，将靶序列的cDNA克隆到到pGEM-T载体上，应用SP6RNA聚合酶经体外转录得到靶序列，作为RT-PCR反应体系优化和评价实验的模板。对RT-PCR反应体系中的Mg2+，dNTP和引物浓度进行优化。将体外转录得到的RNA作为模板，对方法的灵敏度，定量线性范围，精密度等进行评价。　　结论：本实验建立的自身淬灭实时荧光定量RT-PCR能够快速，准确，敏感地对SARS冠状病毒核酸进行定量分析，具有较大的定量范围。有望为临床SARS冠状病毒基因的早期定量检测提供一种新型的，更为经济有效的方法。

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前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述一SARS实验室诊断的进展

综述二实时PCR的定量原理及荧光化学技术

致谢

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