幽门螺杆菌融合蛋白VacA-HpaA卵黄抗体的制备及体外试验

摘要

第一部分幽门螺杆菌融合蛋白VacA—HpaA 卵黄抗体的制备 目的：采用基因工程技术大量表达幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H．pylori)细胞空泡毒素(vacuolatingcytotoxinantigenA，VacA)与粘附素(HelicobacterpyloriadhesinA，HpaA)的融合蛋白(VacA-HpaA)，鉴定其抗原性与免疫原性后，以此融合蛋白作为抗原，制备高效价的VacA-HpaAIgY。 方法：通过大量培养重组菌pQE30-VacA-HpaA-DHsa，诱导表达获得融合蛋白VacA-HpaANi2+_NTA树脂纯化。用Westernblot鉴定融合蛋白VacA-HpaA对VacA和HpaA的抗原特异性，用融合蛋白免疫兔，获得多克隆抗血清，采用间接ELISA法检测其分别针对VacA和HpaA的免疫原性。将纯化的融合蛋白免疫鸡，水稀释结合氯仿有机沉淀法提取IgY。ELISA法测定抗体产生的时间一效价变化。硫酸铵沉淀法纯化浓缩VacA-HpaAIgY，SDS-PAGE分析纯度，Bradford法测定蛋白含量，Westernblot检测其分别对VacA和HpaA的特异抗原性，E．ISA法检测效价。 结果：1．目的蛋白主要以包涵体形式表达，经NI2+—NTA柱纯化，可获得纯度为30％以上的融合蛋白，Bradford法测得蛋白质含量为0．72mg／ml；分别具有VacA和HpaA的抗原性和免疫原性；2．融合蛋白免疫鸡后的蛋黄提取物可与该蛋白发生免疫反应；3．IgY效价总体上随免疫时间增加而升高。4．获得的VacA-HpaAIgY经纯化浓缩后，纯度为60％左右，效价为1：12800，蛋白浓度为22mg/ml，5．Westernblot显示在27000和30000处分别有相应条带，显示其对VacA和HpaA有相应抗原性。6．VacA-HpaAIgY能与VacA和HpaA反应，效价可达1：3200和1：6400。 结论：表达的VacA-HpaA融合蛋白分别对VacA和HpaA均具有良好的抗原性和免疫原性；成功制备了高浓度、较高效价的融合蛋白鸡卵黄抗体(VacA-HpaAIgY)，该IgY能与VacA和HpaA发生特异性反应，为进一步研究其理化性质和生物学特性奠定了基础。第二部分幽门螺杆菌融合蛋白VacA-HpaA 卵黄抗体的体外研究 目的：研究VacA-HpaA融合蛋白的鸡卵黄抗体(IgY)的理化特性和生物学活性，评价其抗H．pylori感染的可行性，为制备集预防与治疗为一体的抗H．pylori感染的制剂奠定基础。 方法：1、检测VacA-HpaAIgY的耐热性、耐酸性及其对酶消化的耐受作用2、将VacA-HpaAIgY与纯培养的H．pylori混合孵育，观察不同浓度IgY的抑菌作用；3、用MTT法检测不同浓度VacA-HpaAIgY对细胞毒活性的中和作用；4、用TUNEL法和流式细胞技术检测VacA-HpaAIgY对菌体蛋白致凋亡的细胞毒活性的中和保护作用；5．用扫描电镜观察VacA-HpaAIgY对AGS细胞粘附的中和作用。 结果：1、该IgY抗体经巴氏消毒后抗体活性不丢失；具有一定的耐酸性，在pH>4时，抗体活性较稳定，在pH<4后，抗体活性下降很快；对胃蛋白酶有一定的耐受性；2、该IgY抗体对H．pylori菌的生长具有浓度依赖性和pH依赖性抑菌作用；3、vacA--hpaAIgY对细胞毒活性有中和作用，且具有量效性和时效性；4、IgY抗体浓度依赖性地阻断H．pylori菌体蛋白的致细胞凋亡毒活性；5、IgY抗体可阻止H．pylori菌体蛋白的粘附作用。 结论：该IgY具有良好的理化和生物学特性，可用于制备抗H．pylori感染的防治制剂。

目录

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符号说明

前言

第一部分幽门螺杆菌融合蛋白VacA-HpaA卵黄抗体的制备

第二部分幽门螺杆菌融合蛋白VacA-HpaA卵黄抗体的体外研究

附图

文献综述幽门螺杆菌体内试验的研究现状

致谢

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