S100A2和S100A6与Wnt/β-catenin信号途径的相互作用研究

摘要

研究背景与目的： 肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与的复杂的生物学过程。肿瘤细胞最明显的特征就是增殖失控，而在肿瘤细胞内与生长分化有关的信号转导障碍则是导致增殖失控的重要因素。Wnt／p—catenin信号途径是最典型的与肿瘤发生发展密切相关的重要信号途径之一。该途径中的Writ信号通过dishevelled(DVL)转导至胞浆并抑制由p。连环蛋白(p-catenin)、结肠癌抑制因子(adenomatouspolyposiscoli，APC)、糖原激酶合成酶一3β(glycogensynthasekinase-3p，GSK-3p)和Axin组成的降解复合体对p—catenin的磷酸化，从而抑制p—catenin的磷酸化依赖的降解，使胞浆内游离β—catenin水平增高并进入细胞核内，与T细胞因子4(Tcellfactor4，TCF4)结合，致p—catenin／TCF4的活性增高；而β—catenin／TCF4的活性增高是大多数(60％-80％)肿瘤发生发展中的重要事件。 p．catenin活性增高的主要原因是，p．catenin基因的活化突变和参与B．catenin降解的分子的异常。在p—catenin活性增高的肿瘤中，只有4％一10％存在p—catenin基因的活化突变，其余则多来自参与p—catenin降解的分子的异常。例如，结直肠癌存在p—catenin活性增高，除4％一10％的p—catenin基因的活化突变外，85％则来自APC基因的失活突变；但在结直肠癌以外的大多数肿瘤却并不存在如此高发的APC突变，而且迄今也未发现导致其p—catenin／TCF4的活性增高的主要原因。 S1.00蛋白家族是一组具有EF-手形的钙依赖的调节蛋白，具有多种生理功能，参与细胞增殖和分化、钙稳态、蛋白质磷酸化、酶活性和转录因子的调节。迄今，已发现20个成员，其中有数个成员在多种肿瘤中表达异常，并与肿瘤的浸润、转移和病人的预后有关，提示该家族也与肿瘤的发生发展密切相关。我们的前期研究以及他人的报道均提示该家族可能参与了Wnt／p—catenin信号途径的调节，但其具体关系和机制尚不明了。 为此，本课题首先选择了S100蛋白家族中S100A2和S100A6，通过Westernblot、荧光素酶活性测定和免疫细胞化学法研究它们对Wnt／p．catenin信号途径的影响，并通过GST-Pulldown／Westernblot方法究S100A2和S100A6与Wnt／p．catenin信号途径主要成员p—catenin、GSK一3p、DVL和Axin之间的相互作用，以探讨其对Wnt／p—catenin信号途径作用的分子机制，为阐明Wnt／p—catenin信号途径和S100蛋白家族在肿瘤发生发展中的作用、相互作用及可能机制提供实验依据，为发现肿瘤防治的新分子靶标和策略奠定基础。 方法： 1．融合蛋白GST-Sl00A2和GST-Sl00A6的制备：用氯化钙法将已经构建的pGST-Moluc-Sl00A2和pGST-Moluc-S100A6质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达；冰上超声裂解细菌后，用谷胱甘肽一琼脂糖4B球珠(GlutathioneSepharose4Bbeads)从细菌裂解液中分离纯化GST-S100A2和GST-S100A6，并通过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate·polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)和[IQuantityOne软件鉴定和分析纯化效果，用Bradford方法进行蛋白定量，分装后一80℃保存备用。 2．分别用GST-S100A2和重组腺病毒AdSl00A6干预骨肉瘤细胞株MG63和结肠癌细胞株HCTl16，Westernblot检测被干预细胞中p．catenin的水平。 3．pTOP-Luc转染人胚肾(humanembryokindey，HEK)293细胞后，分别用GST-S100A2和GST-S100A6处理细胞，通过荧光素酶活性分析探讨S100A2和S100A6对β—catenin／TCF4活性的影响。 4．用免疫细胞化学法检测AdSl00A6感染后HCTll6细胞中p—catenin表达部位的变化。 5．电穿孔法将pcDNA-GSK-3p—HA、pCMV-DVL-Myc和pCMV-Axin-Myc质粒分别转染对数生长期的HEK293细胞，制备分别富含GSK-3p—HA、DVL-Myc和Axin-Myc的细胞裂解液；含p—catenin的细胞裂解液则通过直接裂解HEK293细胞获得。 6．通过GST-Pulldown／Westernblot技术检测GST-S100A2和GST-S100A6与p．catenin、GSK-3p—HA、Axin-Myc和DVL-Myc之间的相互作用，以GST蛋白为阴性对照，以富含相应蛋白的细胞裂解液直接作阳性对照。 结果： 1．0．1mmol／LIPTG可以有效地诱导融合蛋白GST-S100A2和GST-S100A6以可溶性形式表达；用谷胱甘肽一琼脂糖4B球珠分离纯化这两种融合蛋白，其纯度达92％；每升重组菌培养物中可获得3mg纯化蛋白。 2．Westernblot分析GST-S100A2和AdSl00A6分别处理的MG63和HCTl16细胞裂解液发现：1)GST-S100A2-MG63组的杂交带明显较GST对照组增粗，灰度值升高了0．49倍，差异具有显著性(P<0．05)；AdSl00A6-MG63组比AdGFP对照组增粗，灰度值升高了1．37倍，差异具有显著性(P<0．01)。2)GST-S100A2一HCTl16组的杂交带明显较GST对照组和空白对照组增粗，其灰度值分别升高了0．97倍和0．90倍，差异具有显著性(P<0．01)，而GST对照组与空白对照组之间差异无显著性(P>0．05)；AdSl00A6-HCTl16组的杂交带明显较AdGFP对照组和空白对照组增粗，其灰度值分别升高了1．36倍和1．61倍，差异具有显著性(P<0．01)，而AdGFP对照组与空白对照组的差异无显著性(P>0．05)。 3．荧光素酶活性分析发现，GST-S100A2作用后的细胞中荧光素酶活性增加12．3倍，GST-S100A6作用的细胞中荧光素酶活性增加了20．2倍，与对照组的差异均有显著性(P<0．01)。 4．免疫细胞化学检测p—catenin水平发现，空白对照组和AdGFP组的HCTl16细胞是胞浆和核膜呈棕黄色，而感染AdSl00A6的HCT¨6细胞除胞浆呈棕色外，其胞核也明显呈棕黄色。 5．用HA或Myc的抗体经Westernblot分析证实pcDNA-GSK一3p—HA、pCMV-DVL-Myc和pCMV-Axin-Myc质粒分别转染后36h的293细胞中均存在相应的蛋白GSK-3p—HA、DVL-Myc和Axin-Myc，表明这些质粒均成功转染和表达；293细胞裂解液用p—catenin抗体经Westernblot分析，亦证实其中存在p—catenin。 6．通过GST-Pulldown／Westernblot技术检测发现：1)GST-S100A2和GST-S100A6与p—catenin存在直接相互作用；2)GST-S100A2和GST-S100A6与GSK-3β存在直接相互作用；3)GST-S100A6与DVL有直接相互作用，而GST-S100A2与DVL之问未检测到特异性相互作用；4)GST-S100A2和GST-S100A6与Axin之间均未检测到特异性相互作用。 结论： 1．pGST-Moluc-S100A2和pGST-Moluc-S100A6在大肠杆菌BL2l中有效表达了可溶性GST-S100A2和GST-S100A6；经谷胱甘肽一琼脂糖4B球珠分离纯化后，这两种融合蛋白的纯度达92％，并有生物学活性。 2．S100A2和S100A6能够增加细胞内Wnt／p．catenin信号途径活性，这可能是它们参与肿瘤发生发展的重要机制之一。 3．S100A2与Wnt／p—catenin信号途径主要蛋白p—catenin和GSK一3p之间存在直接相互作用：S100A6与p—catenin、GSK-3p和DVL之间存在直接相互作用；这些相互作用可能通过直接和／或间接的方式增加p—catenin稳定性，从而导致胞内p—catenin水平增高、Wnt／β-catenin信号途径活性的增加。 总之，本课题通过Westernblot、荧光素酶活性测定和免疫细胞化学法研究了S100A2和S100A6对Wnt／p—catenin信号途径的影响，并通过GST-Pulldown／Westernblot方法检测了S100A2和S100A6与Wnt／p—catenin信号途径主要成员p．catenin、GSK一3p、DVL和Axin之间的相互作用，初步探讨了S100A2和S100A6对Wnt／p—catenin信号途径作用的分子机制，为阐明Wnt／p—catenin信号途径和S100蛋白家族在肿瘤发生发展中的作用、相互作用及可能机制提供了实验依据，为寻找肿瘤防治的新的分子靶标和策略奠定了基础。

目录

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符号说明

摘要

前言

第一部分融合蛋白GST-S100A2/GST-S100A6的制备

第二部分S100A2和S100A6对Wnt/β-catenin信号途径的作用

第三部分S100A2和S100A6与Wnt/β-catenin信号途径主要成员的相互作用

全文小结

文献综述 Wnt/β-连环蛋白信号途径与肿瘤研究新进展

致谢

硕士期间发表的文章