环磷酰胺代谢产物丙烯醛对未成熟睾丸氧化应激损伤及银杏黄酮的保护机制研究

摘要

背景：烷化剂环磷酰胺(cyclophosphamide，CP)虽已有研究证实其可致性腺损害，但至今在儿童的各类恶性肿瘤、自身免疫性疾病等中仍在广泛应用。临床回顾性和动物实验研究(包括本课题组前期研究)已证实，CP对男性生精功能具有明确的损伤作用。但CP所致未成熟睾丸损伤的机理尚无公认的解释，也给寻找保护措施的研究带来了困难。既往的研究主要集中在CP抗肿瘤成分磷酰胺氮芥，并认为是其直接作用于生精干细胞而导致其凋亡坏死所致，近年研究发现，CP致睾丸氧化应激损伤并破坏其生精微环境可能是另一重要机理。 CP是一种无活性的前体药物，在体内被细胞色素p450代谢后才具有抗肿瘤作用等生物活性。而丙烯醛(Acrolein，ACR)是CP的主要代谢副产物，ACR对肝脏，肾脏，心脏等器官的毒性已有报告，最明确的是可导致出血性膀胱炎。CYP3A4，CYP3A5是CP代谢产生ACR的关键酶，除了在肝脏和肾脏高表达外，在睾丸Sertoli细胞中也有较高表达。同时ACR是一种强氧化剂，因此提示ACR不但可存在睾丸组织中，而且其氧化应激作用完全可导致未成熟睾丸的损害。 已研究证实银杏叶中的有效成分一银杏黄酮具有良好的抗氧化作用，同时，银杏黄酮还可以抑制肿瘤细胞的增殖，因而在CP化疗过程中辅以银杏黄酮有可能发挥保护性腺和抗肿瘤的双重作用。 目的：通过建立CP损伤未成熟睾丸SD大鼠模型，探讨CP睾丸毒性与ACR的氧化应激损伤的相关性，及其作用可能的靶细胞，在此基础上分离培养未成熟SD大鼠睾丸的Sertoli细胞，进一步研究ACR对Sertoli细胞氧化应激损伤及银杏黄酮保护作用的机理，最后在体内探讨银杏黄酮对CP睾丸毒性的防护作用，为进一步临床应用奠定理论基础。 方法：①建立未成熟SD大鼠CP化疗睾丸损伤模型，光镜及电镜技术观察睾丸组织细胞形态学改变、性激素检测、精子头计数等评估其生精功能改变。并通过体内实验，免疫组织化学法探讨CP睾丸损伤与ACR的相关性，以及可能靶细胞。同时检测睾丸组织抗氧化酶活性及氧化应激反应标志物的改变，研究CP化疗睾丸损伤与氧化应激反应的相关性，初步探讨体内CP氧化应激损伤的机理；②建立未成熟SD大鼠睾丸Sertoli细胞原代培养模型，鉴定细胞纯度，以ACR作为体外干预因素，研究ACR对Sertoli细胞体外毒性作用机理。光镜下直接观察细胞形态改变，免疫ICC研究ACR作用的靶点，分光光度法测定Sertoli细胞主要抗氧化酶及氧化应激反应标志物的改变，探讨体外ACR对Sertoli细胞损伤的可能机理；③在体外ACR对Sertoli细胞损伤的研究基础上，加用银杏叶标准提取物银杏黄酮作为干预因素，利用光镜技术观察细胞形态的改变，分光光度法测定Sertoli细胞主要抗氧化酶及氧化应激反应标志物的改变，半定量RT-PCR分析抗氧化相关酶的基因表达改变，探讨银杏黄酮体外对Sertoli细胞ACR所致的氧化应激损伤的保护作用及机制；④通过体内实验，未成熟SD大鼠银杏黄酮溶液连续灌胃1周后，予CP睾丸毒性化疗剂量化疗，光学显微镜电镜观察睾丸组织形态改变，急性期酶分析法测定睾丸内抗氧化物相关酶SOD和GR活性及总抗氧化能力，半定量RF-PCR分析抗氧化相关酶的基因表达改变，恢复期用精子头计数及血清性激素改变了解生精功能改变，探讨银杏黄酮在体内对CP所致未成熟毒性的保护作用。 结果： 1.CP腹腔注射后急性期(24h)大鼠睾丸损伤相关检测结果 1)ACR抗原主要位于Sertoli细胞核内，ACR改变的蛋白质含量较对照组显著升高(P<0.05)，Correlate相关分析提示ACR抗体阳性表达量与用药剂量呈正相关(r=0.763，P<0.05)。 2)抗氧化能力：各实验组T-AOC，GR和SOD活性与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，Correlate相关分析提示，三个指标均与CP剂量呈负相关(r=-0.893,-0.934,-0.950；P<0.01)； 3)氧化应激反应标志：MDA和OH，各实验组较对照组均有显著性差异(P<0.05)，Correlate相关分析提示，两项指标均与CP剂量正相关(r=0.888，0.937；P<0.01)。 2.CP腹腔注射后恢复期(4w)大鼠睾丸损伤相关检测结果 1)睾丸指数(睾丸质量/体重)：实验组较对照显著下降(P<0.05)，且与CP剂量负相关(r=-0.779 P<0.01)； 2)组织学改变：实验组光镜下见睾丸组织形态有不同程度的损伤，损伤程度与CP剂量正相关；电镜下见Sertoli细胞线粒体、内质网损伤明显，提示CP主要损伤未成熟睾丸组织中的Sertoli细胞，但Leydig细胞未见明显结构异常。 3)精子头部计数：各实验组与对照组的比较，均有显著降低(P<0.01)，Correlate相关分析提示精子头部计数也与CP剂量呈负相关，其相关系数为-0.942，P=0.00。 4)性激素：实验组ITI均较对照组显著增高(P<0.05)，Correlate相关分析提示ITT与CP剂量正相关(r=0.893，P<0.01)；实验组血清中FSH、LH较对照组显著升高(P<0.01)，而同一时期实验组和对照组比较血清中T的水平，无统计学差异(P>0.05)。Correlate相关性分析提示，血清FSH和LH测量值与CP剂量正相关(r=0.865，0.850：P<0.05)。 3.原代培养未成熟SD大鼠的Sertoli细胞形态为：贴壁生长，不规则的多边形， Sertoli细胞约占培养细胞总量的90％以上，细胞的突起融合形成非常牢固的细胞间连接，界限不清。胞核清晰可见，有2-4个核仁。鉴定活细胞率为92％-95％，其纯度达95％(P<0.05)。 4.ACR孵育3 h和12h后Sertoli细胞损伤检测结果 1)MTT：除10μM组外，其余各组细胞活力与阴性对照组均有显著性差异(P<0.05)，CD50分别为200和105μM。 2)ICC：各实验组ACR-Pro表达量较对照组均有显著升高(P<0.05)不同剂量和作用时间组之间两两比较也有显著性差异(P<0.05)，阳性表达主要位于细胞核内。 3)氧化应激反应标志：实验组MDA和OH含量较正常对照组显著增高(P<0.05)，MDA和OH的含量与ACR的剂量和作用时间正相关(P<0.05)。 4)抗氧化能力：实验组T-AOC，SOD和GR活性均较正常对照组显著降低(P<0.05)，且三个指标与ACR剂量和作用时间负相关(P<0.05)。 5.银杏黄酮在体外对接触ACR的Sertoli细胞的保护作用 1)光镜下连续动态观察发现，预加银杏黄酮和Vit E组，细胞暴露于ACR后，形态无明显改变；银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无明显差异。 2)MTT：银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组细胞活性与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组细胞活性均较阴性对照组显著升高(P<0.05)，但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。 3)ICC检测ACR-Pro结果：银杏黄酮与ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组细胞均较阴性对照组显著升高(P<005)，但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。 4)抗氧化能力：T-AOC，SOD和GR活性测试结果，银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组均较阴性对照组显著升高(P<0.05)，但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。 5)氧化应激反应标志：各组细胞的MDA、OH测试结果，银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组细均较阴性对照组显著降低(P<0.05)，但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。 6)抗氧化酶基因表达：各组细胞的Cu-Zn SOD、GPx的mRNA测试结果，银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。 结论： 1.CP在体内可以致睾丸组织氧化抗氧化平衡破坏，即抗氧化能力降低，氧自由基堆积，其主要毒性因子是其代谢产物ACR，且作用的靶细胞主要是Sertoli细胞。 2.ACR在体外可以明显降低Sertoli细胞抗氧化能力，细胞氧化应激反应增强，清除自由基能力降低，细胞活力降低。 3.在体外银杏黄酮可提高Sertoli细胞在受到ACR氧化损伤时的抗氧化能力，并清除氧自由基，使细胞免受损伤。 4.银杏黄酮在体内可明显减轻CP对未成熟睾丸所致的氧化应激损伤，并使成年后具有正常的生精功能，为进一步的临床应用奠定了理论基础。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

第一部分ACR氧化应激损伤与CP致未成熟睾丸损伤相关性研究

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分ACR体外对未成熟睾丸Sertoli细胞氧化应激损伤

1材料与方法

2结果

3讨论

第三部分体外银杏黄酮对ACR致未成熟睾丸Sertoli细胞损伤的保护作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第四部分体内验证银杏黄酮对CP致幼鼠睾丸毒性的保护作用

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述 男性不育与氧化应激相关性的研究进展

致谢

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