新基因CGI-100在苦参碱诱导K562细胞分化和凋亡中的作用研究

摘要

目的：从传统的中草药中寻找新的抗癌药物，运用现代分子生物学手段对其药理学作用进行新的探索和诠释，已成为当前中草药研究的趋势。苦参碱是从我国传统中药苦参中提取出的一种生物碱活性成分，具有广泛的药理学作用。我们多年来的研究证明，苦参碱在体外可明显抑制人白血病细胞K562的增殖，诱导其向正常形态分化并显著影响细胞周期和端粒酶活性。这些表型的改变是基因差异表达的结果。运用基因表达谱芯片，我们发现了多个相关的差异表达基因，包括功能已知的和功能未明的。 CGI-100是功能未明的基因之一，本课题旨在了解CGI-100基因与苦参碱诱导K562细胞分化和凋亡的关系，为研究肿瘤发生和逆转开辟新的途径；为寻找肿瘤治疗新靶点、探索苦参碱抗肿瘤作用、开发肿瘤治疗新药物提供实验基础。 方法： 1．利用RT-PCR半定量检测苦参碱作用K562细胞前后CGI-100基因的表达情况。 2．从K562细胞中提取总RNA，RT-PCR反应扩增得到CGI-100基因CDS片断，A-T克隆至pMD18-T载体，经测序鉴定后定向亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中，构建得到pIRES2-EGFP/CGI-100重组质粒。 3．将plRES2-EGFP/CGI-100重组质粒转染K562细胞，G418稳定筛选4w后，有限稀释法筛选得到单个克隆K562阳性细胞株，将其命名为K562-CGI-100细胞，以此重组的K562细胞进行后续实验。 4．以K562-CGI-100细胞为实验对象，RT-PCR检测目的基因的表达状况，电镜观察细胞形态学改变，流式细胞术检测细胞周期的变化。 结果： 1．0.1～1.0mg/ml苦参碱处理K562细胞后，CGI-100基因表达呈剂量依赖性下降；0.1mg/ml苦参碱处理K562细胞3h内CGI-100mRNA表达迅速降低，与对照有显著性差异(p<0.05)，3h～48h内保持相同的低表达水平。 2．成功构建带有EGFP筛选标记的CGI-100基因真核表达载体pIRES2-EGFP/CGI-100，经双酶切和质粒测序鉴定，该重组质粒序列正确，基因插入方向正确。 3．将上述构建的真核表达质粒转染K562细胞，经G418抗性筛选和有限稀释筛选出单个阳性细胞克隆，荧光倒置显微镜下观察到细胞内绿色荧光蛋白的表达；RT-PCR鉴定有CGI-100 mRNA的过量表达。该重组K562细胞阳性单个克隆在体外稳定传代扩增后作为后续的实验对象。 4．K562细胞中CGI-100基因的过表达后，细胞常染色质增加，异染色质减少，细胞增殖旺盛，细胞周期中s期细胞增多。 结论： 1．不同浓度的苦参碱诱导K562细胞分化和凋亡的过程中CGI-100表达量出现降低，我们认为苦参碱能抑制CGI-100基因的表达，同时提示该基因可能参与苦参碱作用K562细胞的早期反应。 2．构建并鉴定了含CGI-100基因CDS片断的真核表达质粒。 3．CGI-100基因的过表达能使K562细胞增殖加速、幼稚程度增加。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前 言

第一部分：CGI-100基因在苦参碱作用K562细胞的表达情况

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分：CGI-100基因真核表达载体的构建及鉴定

1材料和方法

2结果

3讨论

第三部分：CGI-100基因的真核表达载体转染细胞及重组细胞的筛选和鉴定及行为学行为改变

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述：白血病干细胞的研究进展

致 谢

攻读学位期间发表和撰写的论文